一种无损鉴定单性态禽类早期性别的PCR方法技术

本发明专利技术属于禽类早期性别鉴定技术领域，具体涉及一种无损鉴定单性态禽类早期性别的PCR方法。该方法通过采集早期禽类的含有羽髓的羽毛，通过简洁高效的方法对DNA进行提取，以提取的DNA为模板采用PCR扩增引物进行PCR扩增，然后将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，扩增结果为单条带则判定为雄性，双条带则判定为雌性。本发明专利技术的方法与现有的方法相比提取的DNA浓度和纯度均明显较高，而且效果也明显优于其他方法，整体操作步骤简单、使用试剂少、耗费时间短、鉴定效果好，适用于大批量性别鉴定。

A PCR method for non-destructive identification of early sex in parthenogenetic birds

【技术实现步骤摘要】
一种无损鉴定单性态禽类早期性别的PCR方法
：本专利技术属于禽类性别鉴定方法
，具体涉及一种无损鉴定单性态禽类早期性别的PCR方法。
技术介绍
：常见的鹌鹑、肉鸽等，由于其具有较高的食用价值，而且繁殖周期短、生长速度快、饲养方便、使用成本低的优点已经成为禽类科学研究的主要模式动物之一。然而这类禽类，属于单性态禽类，是一种在早期无法通过外观鉴定雌雄的禽类，在科学研究中经常需要在早期就要对禽类性别进行区分以开展不同的试验研究，而且在生产上，为了能够顺利开展繁育工作、育种工作同样也需要在早期对禽类的雌雄进行区分。目前禽类早期性别鉴定的方法是采用试剂盒鉴定或者通过采血提取血液DNA进行鉴定，但是试剂盒鉴定的成本每样高达5元、成本较高，步骤繁杂需要9步、工作量大，完成操作需要时间接近1h，不适合于大批量、大规模的使用；而且采血鉴定性别的方法对于那些体积小、早期体弱的单性态禽类造成伤害产生应激，不利于其后续的生长。因此提供一种快速、高效、价廉、对禽类无损的性别鉴定方法是目前急需解决的问题。
技术实现思路
：针对目前的禽类性别鉴定方法存在成本高、步骤繁琐、时间长、对早期禽类有损伤的缺陷和问题，本专利技术提供一种快速、高效、价廉、无损鉴定单性态禽类早期性别的PCR方法。本专利技术解决其技术问题所采用的方案是：一种无损鉴定单性态禽类早期性别的PCR方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)采集单性态禽类1-2根含有羽髓的羽毛；(2)将羽毛中的羽髓置于无菌EP管中，加入80μL0.2mol/LNaOH，涡旋混匀，于95℃条件下加热5-10min，再加入200μL无水乙醇，涡旋混匀，12000r/min离心3min，弃上清；再次加入200μL无水乙醇，涡旋混匀，12000r/min离心3min，弃上清，风干待乙醇完全挥发，加入100μLTE溶液溶解，涡旋混匀，获得基因组DNA样品，将基因组DNA样品进行稀释，于-20℃保存备用；(2)以提取的DNA为模板，采用PCR扩增引物进行PCR扩增；(4)将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，扩增结果为单条带则判定为雄性；扩增结果为双条带则判定为雌性。上述的一种无损鉴定单性态禽类早期性别的PCR方法，步骤(2)中是将羽毛中的羽髓置于无菌EP管中，加入80μL0.2mol/LNaOH，涡旋混匀，于95℃条件下加热10min，再加入200μL无水乙醇，涡旋混匀，12000r/min离心3min，弃上清；再次加入200μL无水乙醇，涡旋混匀，12000r/min离心3min，弃上清，风干待乙醇完全挥发，加入100μLTE溶液溶解，涡旋混匀，获得基因组DNA样品，将基因组DNA样品稀释50倍，于-20℃保存备用。上述的一种无损鉴定单性态禽类早期性别的PCR方法，步骤(1)中采集的羽毛为单性态禽类翅膀处的羽毛。上述的一种无损鉴定单性态禽类早期性别的PCR方法，所述PCR扩增引物为：2550F：5’-GTTACTGATTCGTCTACGAGA-3’；2718R：5’-ATTGAAATGATCCAGTGCTTG-3’。上述的一种无损鉴定单性态禽类早期性别的PCR方法，PCR反应体系包括：2×PCRTaqMasterMix5μL，上、下游引物各0.2μL，DNA模板1μL，ddH2O3.6μL。上述的一种无损鉴定单性态禽类早期性别的PCR方法，PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，退火温度54℃，时间30s，72℃延伸30s，共33个循环；72℃5min；12℃保存。上述的一种无损鉴定单性态禽类早期性别的PCR方法，步骤(2)中所述DNA样品稀释的倍数为50或100倍。本专利技术的有益效果：1、本专利技术鉴定单性态禽类早期性别的方法，只需要选取禽类一到两根含有羽髓的羽毛即可进行鉴定，不用采取血液，不会给幼禽造成伤害，而且羽毛的再生能力强，避免了采血引起禽类感染，减少禽类应激，能够为珍稀野生禽类的性别鉴定奠定基础。2、采用本专利技术的方法对羽毛的DNA进行提取，与试剂盒提取、加热法提取相比步骤简便、耗费时间短，提取出的DNA的浓度远远高于试剂盒获得的DNA浓度，而且从OD260/OD280值和OD260/OD230值可以看出采用本专利技术的方法提取出的DNA纯度明显高于目前常用的提取方法。3、本专利技术的方法使用仪器少、操作方便，步骤简单、需要时间短，试剂用量少、提取成本低，而且早期禽类体型较小，采集羽毛相比采血更为容易，简便易行，高效价廉效果好，可用于大批量禽类的早期性别鉴定，适用于推广使用。附图说明：图1为本专利技术鉴别鹌鹑早期性别的电泳图。图2为本专利技术方法验证鹌鹑性别的解剖图。图3为不同方法提取鹌鹑羽毛基因组DNA的电泳对比图。图4为不同方法验证同只鹌鹑的性别鉴定对比图。具体实施方式：单性态禽类，如鹌鹑、鸽子等，很难从外观形态或其他行为上区分雌雄性别，但是其肉质味道鲜美，营养丰富，具有较高的食用价值，是特种经济类禽类，而且鹌鹑蛋和鸽蛋也逐渐成为人们的一道菜肴，养殖效益较高。但是这类单性态禽类在早期很难通过外观形态对其性别进行鉴定，在人工养殖上，为了实现最大的经济效益，需要在禽类的幼苗期对其进行性别鉴定。下面结合附图和实施例对本专利技术进一步说明。实施例1：本实施例以鹌鹑为例，对本专利技术的一种无损鉴别单性态禽类性别的PCR方法进行详细阐述，该方法通过采集3日龄鹌鹑翅膀处含有羽髓的羽毛进行DNA提取，然后进行PCR扩增。试验所用仪器和试剂为：超微量分光光度计NanoDrop1000(Thermo公司，美国)；2×PCRTaqMasterMix、琼脂糖、核酸染料Gelstain、DNAMarker，购自北京全式金生物技术有限公司；性别鉴定引物2550F/2718R由郑州生工公司合成；2×TransTaq-TPCRSuperMix(全式金生物技术有限公司，北京)。具体方法为：(1)选取70只3日龄鹌鹑，在每只鹌鹑的翅膀处采集2根含有羽髓的羽毛，其中羽毛大小与鹌鹑体型相近。(2)将每只鹌鹑羽毛的羽髓分别置于1.5mL的EP管中，按照顺序进行编号，向每支EP管中加入80μL0.2mol/LNaOH，涡旋混匀，于95℃条件下加热5min，再加入200μL无水乙醇，涡旋混匀，12000r/min离心3min，弃上清；再次加入200μL无水乙醇，涡旋混匀，12000r/min离心3min，弃上清，风干待乙醇完全挥发，加入100μLTE溶液溶解，涡旋混匀，获得基因组DNA样品，将基因组DNA样品稀释50倍，于-20℃保存备用；(3)以稀释后的DNA为样品，根据鸡性染色体上CHD1基因内含子序列而设计的性别鉴定PCR引物进行PCR检测。具体引物序列为：2550F：5’-GTTACTGATTCGTCTACGAGA-3’；2718R：5’-ATTGAAATGATCCAGTGCTTG-3’。<本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种无损鉴定单性态禽类早期性别的PCR方法，其特征在于：包括以下步骤：/n(1)采集单性态禽类1-2根含有羽髓的羽毛；/n(2)将羽毛中的羽髓置于无菌EP管中，加入80μL 0.2mol/L的NaOH，涡旋混匀，于95℃条件下加热5-10min，再加入200μL无水乙醇，涡旋混匀，12000r/min离心3min，弃上清；/n再次加入200μL无水乙醇，涡旋混匀，12000r/min离心3min，弃上清，风干待乙醇完全挥发，加入100μL TE溶液溶解，涡旋混匀，获得基因组DNA样品，将基因组DNA样品进行稀释，于-20℃保存备用；/n(3)以提取的DNA为模板，采用PCR扩增引物进行PCR扩增；/n(4)将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，扩增结果为单条带则判定为雄性；扩增结果为双条带则判定为雌性。/n

【技术特征摘要】
1.一种无损鉴定单性态禽类早期性别的PCR方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)采集单性态禽类1-2根含有羽髓的羽毛；
(2)将羽毛中的羽髓置于无菌EP管中，加入80μL0.2mol/L的NaOH，涡旋混匀，于95℃条件下加热5-10min，再加入200μL无水乙醇，涡旋混匀，12000r/min离心3min，弃上清；
再次加入200μL无水乙醇，涡旋混匀，12000r/min离心3min，弃上清，风干待乙醇完全挥发，加入100μLTE溶液溶解，涡旋混匀，获得基因组DNA样品，将基因组DNA样品进行稀释，于-20℃保存备用；
(3)以提取的DNA为模板，采用PCR扩增引物进行PCR扩增；
(4)将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，扩增结果为单条带则判定为雄性；扩增结果为双条带则判定为雌性。


2.根据权利要求1所述的一种无损鉴定单性态禽类早期性别的PCR方法，其特征在于：步骤(2)中是将羽毛中的羽髓置于无菌EP管中，加入80μL0.2mol/LNaOH，涡旋混匀，于95℃条件下加热10min，再加入200μL无水乙醇，涡旋混匀，12000r/min离心3min，弃上清；再次加入200μL无水乙醇，涡旋混匀，12000r/min离心3min，弃上清，风干待乙醇完全挥发，加入100μLTE溶液溶解，...

【专利技术属性】
技术研发人员：秦清明，李治利，易先国，张自富，赵云焕，赵瑜，朱忠珂，
申请(专利权)人：信阳农林学院，
类型：发明
国别省市：河南;41