“人源性”致心律失常性右室心肌病疾病模型的建立方法技术

本发明专利技术公开了一种“人源性”致心律失常性右室心肌病(ARVC)疾病模型的建立方法。该方法是将ARVC患者皮肤进行原代培养获得成纤维细胞，通过非整合性仙台病毒诱导获得ARVC病人特异性诱导多能干细胞(iPSC)，再将其定向分化为ARVC病人特异性的心肌细胞，以建立一个稳定的体外心肌细胞疾病模型。本发明专利技术可基于iPSC技术建立稳定的人源性ARVC模型，形态与功能均符合ARVC病理特征，该模型适合用于ARVC相关病理机制研究以及个体化药物筛选。

【技术实现步骤摘要】
“人源性”致心律失常性右室心肌病疾病模型的建立方法
本专利技术属于生物医学
，公开了一种“人源性”致心律失常性右室心肌病(ARVC)疾病模型的建立方法，可用于ARVC的相关病理机制研究及其治疗和预防药物的研发。
技术介绍
致心律失常性右室心肌病(Arrhythmogenicrightventricularcardiomyopathy，ARVC)是一种心肌病，多见于青壮年男性，男女比例约为2.7:1。该病病理特征为右心室内的心肌萎缩和纤维脂肪组织替代，临床常表现为右心室扩大、心律失常、猝死和心力衰竭，是运动性猝死中的常见死因。30％～50％的ARVC病例具有家族性，主要表现为常染色体显性遗传，外显率不一。目前已知至少9个ARVC相关基因，其中多数为编码桥粒蛋白的基因。迄今为止，关于ARVC疾病发生的分子机制研究并不清楚，且存在很大争议，主要为基于小鼠疾病模型的研究。然而，小鼠与人类在各种生理系统上存在很大差异(例如人心肌细胞的搏动频率是60次/分，而小鼠的搏动频率是400-600次/分)，很多研究结果不能直接应用于人类疾病。因此，如何建立一个“人源性”心肌细胞模型对于ARVC等心血管疾病的研究十分重要。人诱导多能干细胞(humaninducedPluripotentStemCells，hiPSCs)的出现为转化医学和再生医学提供了强大的动力和革命性的模式转变，拉近了干细胞用于临床疾病治疗的距离。hiPSCs广泛地应用于心血管疾病的研究中，在疾病模型建立、疾病分子机制研究以及新药研发等方面具有巨大的潜在价值。与人成体干细胞相比，hiPSCs的一个明显优势在于它的多能性，而正是这种多能性，赋予了它可以分化成为人体内任意一种细胞的能力，如心肌细胞、血管细胞、神经细胞、肝脏细胞等。对于心血管疾病研究而言，人原代心肌细胞是最理想的细胞资源，然而很难获取，且体外培养条件苛刻，因此其应用受到很大限制。应用心肌定向分化技术，可以将hiPSCs分化成为心肌细胞，这些hiPSC衍生的心肌细胞(hiPSC-CMs)携带人类基因组、具有“人源性”生理内环境、获取相对容易并可体外长期培养，是目前已知的与人原代心肌细胞最为相似的细胞资源。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有技术的不足，提供了“人源性”致心律失常性右室心肌病疾(ARVC)病模型的建立方法。“人源性”致心律失常性右室心肌病疾病模型的建立方法包括如下步骤：1)原代培养获得成纤维细胞将ARVC患者皮肤组织块儿用PBS+1％青链霉素润洗，吸走PBS，加入胶原酶于37℃消化6小时。随后加入DMEM+10％FBS+1％青链霉素培养基，置于培养箱培养，等待皮肤组织贴壁，每隔4天换液。当培养皿中成纤维细胞长满后获得P0代成纤维细胞，冻存保种并传代扩增培养。其中所述的PBS为磷酸盐平衡生理盐水，DMEM是本领域熟知的一种含各种氨基酸和葡萄糖的培养基，PBS+1％青链霉素及DMEM+10％FBS+1％青链霉素培养基中的百分比均按体积比计算。2)ARVC病人特异性iPS细胞株的建立将成纤维细胞种入孔板中，选择1孔刚好长满的细胞进行仙台病毒感染，24小时后换成DMEM+10％FBS+1％青链霉素培养基，每隔1天换液，第7天将细胞传入预先铺有Matrigel的培养皿中，同时培养基改为mTeSR。将单个克隆挑取到用预先铺有Matrigel的孔板中，此时细胞为ARVC-iPSCP0代，选择细胞致密、外周没有分化的克隆传代到预先铺有Matrigel的孔板中，此时细胞为P1代；选择细胞致密、外周没有分化的3个克隆传代到用预先铺有Matrigel的孔板中，此时细胞为P2代，在孔板中一直将细胞传代至P20代并每1代都进行保种。其中Matrigel为基底膜基质胶，mTeSR为人多能干细胞无血清培养基；3)ARVC病人特异性心肌细胞的获得采用小分子化合物诱导的2D单层分化方案，其基本技术路线为：第1天完成iPSCs向中胚层的诱导分化，第1-3天完成中胚层向心脏中胚层的诱导转分化，第4-7天完成中胚层向心肌细胞的诱导分化，第7天以后主要是心肌细胞的成熟过程。首先将iPSCs按1:8-1:12比例接种至6孔板中，每日更换培养基，当细胞密度达到80％左右可进行分化操作，在分化当天，吸尽陈旧培养基，心肌分化培养基(RPMI+B27-Insulin)清洗一遍，每孔加入含8μM的CHIR的分化培养基2ml；1天后补充心肌分化培养基；2天后更换成心肌分化培养基，每孔2ml；第3天，每孔加入含5μM的IWR的心肌分化培养基2ml，继续培养2天，第4天补充心肌分化培养基；第5天更换成心肌分化培养基；第7天以后更换成心肌细胞培养基(RPMI+B27+Insulin)，此时如果分化效果良好可看到成片跳动的心肌细胞，表明“人源性”致心律失常性右室心肌病疾病模型建立成功。优选的，所述的RPMI+B27-Insulin培养基中，B27-Insulin占总培养液总量的2％。优选的，所述的RPMI+B27+Insulin培养基中，B27+Insulin占总培养液总量的2％。优选的，所述步骤3)中在原有培养基上补充RPMI+B27-Insulin培养基的补充量为原培养基的一半。本专利技术可基于iPSC技术建立稳定的人源性ARVC疾病模型，形态与功能均符合ARVC特征，该模型适合用于ARVC相关病理机制研究以及个体化药物筛选。附图说明图1：iPSC的多能性鉴定结果；图2：正常人组和ARVC病人组心肌细胞的肌丝纹理染色图；图3：ARVC病人组心肌细胞的电生理表型；图4：ARVC病人组心肌细胞的脂肪沉积表型。具体实施方式1)皮肤成纤维细胞的分离及其原代培养：获得皮肤后，切除脂肪组织并把皮肤组织切成小块，用PBS+1％青链霉素润洗1次，吸走PBS后加入胶原酶在37℃消化6小时，消化结束后，加入DMEM+10％FBS+1％青链霉素培养基，放入培养箱培养，等待皮肤组贴壁，每隔4天换液。切勿吹动皮肤组织，1周后可以观察到成纤维细胞。2)ARVC病人特异性iPS细胞株的建立：将成纤维细胞按1×104,2×104,3×104,4×104，6×104,8×104的梯度接种于48孔板中，第2天观察后选择1孔刚好长满的细胞进行仙台病毒感染，24小时后换成DMEM+10％FBS+1％青链霉素培养基，隔日换液，第7天将细胞传入用预先铺有Matrigel的60-mm培养皿中，同时培养基改用mTeSR(STEMCELLTechnologies)。每天观察细胞，待克隆适合挑取后，将单个克隆挑取到用预先铺有Matrigel的96孔板中，此时细胞为P0代。将细胞状态不理想的细胞抛弃，选择状态优良的克隆传代到用预先铺有Matrigel的24孔板中，此时细胞为P1代。选择状态最好的3个克隆传代到用预先铺有Matrigel的12孔板中，此时细胞为P2代，在12孔板中一直将细胞传代至P20代并每1代都进行保种。通过免疫荧光实验NANOG,SSEA4,SOX2和Oct3/4阳性以及碱性磷酸酶染色(APstaining)实验鉴定已建立iPSC的多能性(图1)。3)ARVC病人特异性心肌细胞的获得：采用小分子化合物诱导的2D单层分化方案，其基本技术路线为：第1天完成iPSCs向中胚本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种“人源性”致心律失常性右室心肌病疾病模型的建立方法，包括如下步骤：1)原代培养获得成纤维细胞将ARVC患者皮肤组织块用PBS+1％青链霉素润洗，吸走PBS，加入胶原酶于37℃消化6小时；随后加入DMEM+10％FBS+1％青链霉素培养基，置于培养箱培养，等待皮肤组织贴壁，每隔4天换液，当培养皿中成纤维细胞长满后获得P0代成纤维细胞，冻存保种并传代扩增培养；2)ARVC病人特异性iPS细胞株的建立将成纤维细胞种入孔板中，选择1孔刚好长满的细胞进行仙台病毒感染，24小时后换成DMEM+10％FBS+1％青链霉素培养基，每隔1天换液，第7天将细胞传入预先铺有Matrigel的培养皿中，同时培养基改为mTeSR；将单个克隆挑取到用预先铺有Matrigel的孔板中，此时细胞为ARVC‑iPSCP0代，选择细胞致密、外周没有分化的克隆传代到预先铺有Matrigel的孔板中，此时细胞为P1代；选择细胞致密、外周没有分化的3个克隆传代到用预先铺有Matrigel的孔板中，此时细胞为P2代，在孔板中一直将细胞传代至P20代并每1代都进行保种；3)ARVC病人特异性心肌细胞的获得采用小分子化合物诱导的2D单层分化方案，其技术路线为：第1天完成iPSCs向中胚层的诱导分化，第1‑3天完成中胚层向心脏中胚层的诱导转分化，第4‑7天完成中胚层向心肌细胞的诱导分化，第7天以后为心肌细胞的成熟过程；所述的步骤3)具体操作为：首先将iPSCs按1:8‑1:12比例接种至6孔板中，每日更换培养基，当细胞密度达到80％进行分化操作，在分化当天，吸尽陈旧培养基，心肌分化培养基清洗一遍，每孔加入含8μM的CHIR的分化培养基2ml；1天后补充心肌分化培养基；2天后更换成心肌分化培养基，每孔2ml；第3天，每孔加入含5μM的IWR的心肌分化培养基2ml，继续培养2天，第4天补充心肌分化培养基；第5天更换成心肌分化培养基；第7天以后更换成心肌细胞培养基，此时分化效果良好即可看到成片跳动的心肌细胞，即表明“人源性”致心律失常性右室心肌病疾病模型建立完成。...

【技术特征摘要】
1.一种“人源性”致心律失常性右室心肌病疾病模型的建立方法，包括如下步骤：1)原代培养获得成纤维细胞将ARVC患者皮肤组织块用PBS+1％青链霉素润洗，吸走PBS，加入胶原酶于37℃消化6小时；随后加入DMEM+10％FBS+1％青链霉素培养基，置于培养箱培养，等待皮肤组织贴壁，每隔4天换液，当培养皿中成纤维细胞长满后获得P0代成纤维细胞，冻存保种并传代扩增培养；2)ARVC病人特异性iPS细胞株的建立将成纤维细胞种入孔板中，选择1孔刚好长满的细胞进行仙台病毒感染，24小时后换成DMEM+10％FBS+1％青链霉素培养基，每隔1天换液，第7天将细胞传入预先铺有Matrigel的培养皿中，同时培养基改为mTeSR；将单个克隆挑取到用预先铺有Matrigel的孔板中，此时细胞为ARVC-iPSCP0代，选择细胞致密、外周没有分化的克隆传代到预先铺有Matrigel的孔板中，此时细胞为P1代；选择细胞致密、外周没有分化的3个克隆传代到用预先铺有Matrigel的孔板中，此时细胞为P2代，在孔板中一直将细胞传代至P20代并每1代都进行保种；3)ARVC病人特异性心肌细胞的获得采用小分子化合物诱导的2D单层分化方案，其技术路线为：第1天完成iPSCs向中胚层的诱导分化，第1-3天完成中胚层向心脏中胚层的诱导转分化，第4-7天完成中胚层向心...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁平，沈嘉希，蒋晨阳，孙雅逊，苏俊，宫庭钰，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33