脂肪组织来源复合细胞群及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了脂肪组织来源复合细胞群及其制备方法和应用。本发明专利技术所提供的脂肪组织来源复合细胞群的制备方法，包括如下步骤：(1)洗涤脂肪组织；(2)分离脂肪组织，所述洗涤后的脂肪组织依次经过1.5mm～2.0mm、0.8mm～1.0mm和0.5mm～0.7mm三种不同孔径的刀片式纳米脂肪移植乳化器，离心后将油滴层、成熟脂肪细胞层和生理盐水层去除，收集底部的复合细胞群层；用细胞筛过滤除去复合细胞群层中的细胞碎片和基质成份部分，离心，弃上清，即得所述脂肪组织来源复合细胞群。本发明专利技术通过在切割作用下破碎脂肪组织，降低了对脂肪组织的作用力，避免了对间充质干细胞等目标产物造成损伤，从而保护了细胞结构，提高了产物的治疗效果。

Adipose tissue-derived composite cell population and its preparation and Application

The present invention discloses adipose tissue-derived composite cell population, its preparation method and application. The preparation method of adipose tissue-derived composite cell group provided by the invention includes the following steps: (1) washing adipose tissue; (2) separating adipose tissue. The washed adipose tissue passes through a blade-type nano-fat transplantation emulsifier with different apertures of 1.5mm-2.0mm, 0.8mm-1.0mm and 0.5mm-0.7mm in turn, and oil droplet layer, mature adipose cell layer and physiological saline are centrifuged. Layer removal, collection of composite cell group layer at the bottom, removal of cell debris and matrix components in composite cell group layer by cell sieve filtration, centrifugation, and discarding supernatant, the adipose tissue-derived composite cell group can be obtained. By breaking adipose tissue under cutting action, the force on adipose tissue is reduced, and the damage to target products such as mesenchymal stem cells is avoided, thereby protecting the cell structure and improving the therapeutic effect of the product.

【技术实现步骤摘要】
脂肪组织来源复合细胞群及其制备方法与应用
本专利技术属于干细胞治疗领域，具体地说，涉及脂肪组织来源复合细胞群及其制备方法和应用。
技术介绍
现有技术采用酶消化法制备脂肪组织来源复合细胞群，但酶消化法存在很多不足，限制了脂肪组织来源多细胞成分的临床应用，具体如下：1、酶消化法常用胶原蛋白酶(牛源性)、胶原蛋白酶合并胰蛋白酶(猪源性)，消化脂肪细胞间的胶原蛋白、蛋白质，以获取其中的脂肪组织来源复合细胞群细胞成分，并用牛血清白蛋白(BSA)终止胰蛋白酶的反应，使用了动物源性消化酶，操作复杂，成本较高，以及生物安全隐患。2、酶消化法为保证细胞活力，分离时需要添加人血清白蛋白，使用了稀缺人类资源来源的药品，成本较高。3、酶消化分离的细胞可见大量红色团块，显微镜下观察可见大量圆形均一形态细胞，目前清除红细胞污染的方法一是使用红细胞裂解液，利用低渗原理裂解红细胞，再者或使用淋巴细胞分离液通过密度梯度离心法，二种方法使用的试剂均非医学品，红细胞污染较严重，成本较高。申请号为201180068607.8的中国专利申请公开了一种从脂肪组织获得的源自超声空化的基质或间充质血管提取物和源自其的细胞以及其用途，该专利技术提供的处理方法，其使用超声空化解离脂肪组织内所含有的脂肪细胞和血管且由此获得用于人类个体的间充质或基质血管部分。但超声空化无差别破坏细胞，会损伤间充质干细胞等目标产物，破坏细胞结构，影响产物的治疗效果。申请号为201380044693.8的中国专利申请公开了一种通过超声空化从脂肪组织分离干细胞及使用方法，在一个实施例中，该专利技术涉及用于从脂肪组织分离干细胞的非酶分离方法，其中方法包括用超声空化处理脂肪组织以破碎所述脂肪组织和溶解成熟的脂肪细胞，产生含有可存活的间质细胞/干细胞的间质血管成分。同样地，超声空化无差别破坏细胞，会损伤间充质干细胞等目标产物，破坏细胞结构，影响产物的治疗效果。
技术实现思路
为弥补以上领域的不足，本专利技术提供了一种脂肪组织来源复合细胞群的制备方法，以保护细胞结构，提高产物的治疗效果。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：脂肪组织来源复合细胞群的制备方法，包括如下步骤：(1)洗涤脂肪组织：将获得的脂肪混合物首次离心，取上层脂肪组织，加入生理盐水，再次离心，直至生理盐水澄清，即得洗涤后的脂肪组织；(2)分离脂肪组织：将所述步骤(1)洗涤后的脂肪组织加入螺旋式锁口注射器Ⅰ，用刀片式纳米脂肪移植乳化器将加入脂肪组织的螺旋式锁口注射器Ⅰ与另一个螺旋式锁口注射器Ⅱ连接，将所述脂肪组织经所述刀片式纳米脂肪移植乳化器推注至螺旋式锁口注射器Ⅱ中；(3)所述洗涤后的脂肪组织依次经过1.5mm～2.0mm、0.8mm～1.0mm和0.5mm～0.7mm三种不同孔径的刀片式纳米脂肪移植乳化器，每孔径需经过10次以上处理；(4)将经过刀片式纳米脂肪移植乳化器处理后的脂肪组织收集于离心管中，加入生理盐水，离心分离；离心后的脂肪分为四层，自上向下依次为油滴层、成熟脂肪细胞层、生理盐水层和复合细胞群层；(5)将所述油滴层、成熟脂肪细胞层和生理盐水层去除，收集底部的复合细胞群层；(6)将所述步骤(5)收集的复合细胞群层，用生理盐水重悬，离心洗涤，弃上清；(7)加入生理盐水，用细胞筛滤除复合细胞群层中的细胞碎片和基质成份部分，离心，弃上清，即得所述脂肪组织来源复合细胞群。所述步骤(3)中，所述洗涤后的脂肪组织依次经过2.0mm、1.0mm和0.5mm三种不同孔径的刀片式纳米脂肪移植乳化器。所述步骤(2)中所述刀片式纳米脂肪移植乳化器的推注速度为10ml/3秒～25ml/3秒；所述步骤(1)洗涤后的脂肪组织加入螺旋式锁口注射器Ⅰ的方法为：拨出所述螺旋式锁口注射器Ⅰ的活塞部分，将适量脂肪组织加入螺旋式锁口注射器Ⅰ中，排除多余空气。所述步骤(1)中所述脂肪混合物为临床抽脂获得的脂肪混合物；所述首次离心的速度为700rpm/min～1200rpm/min，离心时间为1min～5min；所述再次离心的速度为800rpm/min～1500rpm/min，离心时间为1min～5min。所述步骤(4)中加入生理盐水的量为：与收集于离心管中的所述经过刀片式纳米脂肪移植乳化器处理后的脂肪组织体积相等；所述离心分离的速度为1200rpm/min～2200rpm/min，离心分离时间为5min～10min。所述步骤(5)中将所述油滴层、成熟脂肪细胞层和生理盐水层去除的方法为：用刻度移液管沿离心管管壁依次将所述油滴层、成熟脂肪细胞层和生理盐水层去除。所述步骤(6)中所述离心洗涤的速度为1000rpm/min～2000rpm/min，离心洗涤时间为1min～5min。所述步骤(7)中所述细胞筛为100μm～200μm的细胞筛；所述离心的速度为1000rpm/min～1800rpm/min，离心时间为1min～5min。所述脂肪组织来源复合细胞群为：去除脂肪组织中的脂肪细胞，保留脂肪组织中的体积微小的基质细胞、间充质干细胞、内皮前体细胞、巨噬细胞、血小板和血管内皮细胞的产物。与超声空化相比，本专利技术通过在切割作用下破碎脂肪组织，降低了对脂肪组织的作用力，避免了对间充质干细胞等目标产物造成损伤，从而保护了细胞结构，提高了产物的治疗效果。其中，脂肪组织是人类或非人类哺乳动物来源。步骤(2)中，使用刀片式纳米脂肪乳化器破碎脂肪组织。本申请的乳化器易清洗和消毒灭菌，且造价低，可一次性使用，生物安全性高。根据脂肪细胞的特性，应用刀片式纳米脂肪乳化器孔径梯度和控性湍流产生的特定压力差的物理方法，选择性地破碎脆弱的单房脂肪细胞以释放油滴，有效去除脂肪组织中的脂肪细胞，保留脂肪组织中的体积微小的基质细胞、间充质干细胞、内皮前体细胞、巨噬细胞、血管内皮细胞和血小板(主要成分是胶原蛋白，弹性蛋白和粘多糖)的产物。经过这个处理后的脂肪组织失去了原本大颗粒的固体性状，转变成富含ECM和基质细胞、间充质干细胞、内皮前体细胞、巨噬细胞、血管内皮细胞的乳糜状液体形态。步骤(3)中，使用不同孔径的乳化器破碎脂肪组织，乳化器的使用顺序为：先使用孔径较大的乳化器，再使用孔径较小的乳化器。与直接使用孔径较小的乳化器相比，本专利技术的乳化器使用顺序，减小了对脂肪组织施加的作用力，从而进一步避免了对细胞造成损伤，保护了细胞结构，提高产物的治疗效果。步骤(3)中，乳化器孔径为0.5mm-2.0mm。步骤(3)中，使用三个乳化器破碎脂肪组织，三个乳化器的孔径分别为1.5mm～2.0mm、0.8mm～1.0mm和0.5mm～0.7mm。优选的，三个乳化器的孔径分别为0.5mm、1.0mm、2.0mm。上述孔径的纳米脂肪乳化器是根据脂肪细胞和脂肪组织来源复合细胞群所含细胞群的直径选择的，具体为三孔式(孔径为2.0mm)、四孔式(孔径为1.0mm)和五孔式(孔径为0.5mm)。本专利技术通过试验发现，脂肪组织来源复合细胞群中的最大细胞为40μm，故本专利技术选用孔径远远大于40μm的纳米脂肪乳化器，以避免对细胞造成损伤，从而保护了细胞结构，提高产物的治疗效果。本专利技术还采用梯度粉碎，使脂肪组织先粉碎成脂肪团块，然后粉碎成小脂肪团块，最后粉碎成SVF细胞群，与直接将脂肪组织粉碎成SVF细胞群相比，本专利技术的方式对脂肪组织本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.脂肪组织来源复合细胞群的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)洗涤脂肪组织：将获得的脂肪混合物首次离心，取上层脂肪组织，加入生理盐水，再次离心，直至生理盐水澄清，即得洗涤后的脂肪组织；(2)分离脂肪组织：将所述步骤(1)洗涤后的脂肪组织加入螺旋式锁口注射器Ⅰ，用刀片式纳米脂肪移植乳化器将加入脂肪组织的螺旋式锁口注射器Ⅰ与另一个螺旋式锁口注射器Ⅱ连接，将所述脂肪组织经所述刀片式纳米脂肪移植乳化器推注至螺旋式锁口注射器Ⅱ中；(3)所述洗涤后的脂肪组织依次经过1.5mm～2.0mm、0.8mm～1.0mm和0.5mm～0.7mm三种不同孔径的刀片式纳米脂肪移植乳化器，每孔径经过10次以上处理；(4)将经过刀片式纳米脂肪移植乳化器处理后的脂肪组织收集于离心管中，加入生理盐水，离心分离；离心后的脂肪分为四层，自上向下依次为油滴层、成熟脂肪细胞层、生理盐水层和复合细胞群层；(5)将所述油滴层、成熟脂肪细胞层和生理盐水层去除，收集底部的复合细胞群层；(6)将所述步骤(5)收集的复合细胞群层，用生理盐水重悬，离心洗涤，弃上清；(7)加入生理盐水，用细胞筛过滤除去复合细胞群层中的细胞碎片和基质成份部分，离心，弃上清，即得所述脂肪组织来源复合细胞群。...

【技术特征摘要】
1.脂肪组织来源复合细胞群的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)洗涤脂肪组织：将获得的脂肪混合物首次离心，取上层脂肪组织，加入生理盐水，再次离心，直至生理盐水澄清，即得洗涤后的脂肪组织；(2)分离脂肪组织：将所述步骤(1)洗涤后的脂肪组织加入螺旋式锁口注射器Ⅰ，用刀片式纳米脂肪移植乳化器将加入脂肪组织的螺旋式锁口注射器Ⅰ与另一个螺旋式锁口注射器Ⅱ连接，将所述脂肪组织经所述刀片式纳米脂肪移植乳化器推注至螺旋式锁口注射器Ⅱ中；(3)所述洗涤后的脂肪组织依次经过1.5mm～2.0mm、0.8mm～1.0mm和0.5mm～0.7mm三种不同孔径的刀片式纳米脂肪移植乳化器，每孔径经过10次以上处理；(4)将经过刀片式纳米脂肪移植乳化器处理后的脂肪组织收集于离心管中，加入生理盐水，离心分离；离心后的脂肪分为四层，自上向下依次为油滴层、成熟脂肪细胞层、生理盐水层和复合细胞群层；(5)将所述油滴层、成熟脂肪细胞层和生理盐水层去除，收集底部的复合细胞群层；(6)将所述步骤(5)收集的复合细胞群层，用生理盐水重悬，离心洗涤，弃上清；(7)加入生理盐水，用细胞筛过滤除去复合细胞群层中的细胞碎片和基质成份部分，离心，弃上清，即得所述脂肪组织来源复合细胞群。2.根据权利要求1所述的脂肪组织来源复合细胞群的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中，所述洗涤后的脂肪组织依次经过2.0mm、1.0mm和0.5mm三种不同孔径的刀片式纳米脂肪移植乳化器。3.根据权利要求1所述的脂肪组织来源复合细胞群的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中所述刀片式纳米脂肪移植乳化器的推注速度为10ml/3秒～25ml/3秒；所述步骤(1)洗涤后的脂肪组织加入螺旋式锁口注射器Ⅰ的方法为：拨出所述螺旋式锁口注射器Ⅰ的活塞部分，将适量脂肪组织加入螺旋式锁口注射器Ⅰ中，排除多余空气。4.根据权利要求1所述的脂肪组织来源复合细胞群...

【专利技术属性】
技术研发人员：蔡哲，
申请(专利权)人：瑞梦德医药科技北京有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11