长末端重复序列LTR70在制备靶向治疗乳腺癌药物中的用途制造技术

本发明专利技术属生物制药技术领域，涉长末端重复序列LTR70在制药中新的用途，本发明专利技术提供了以人内源性逆转录病毒长末端重复序列LTR70作为反义寡核苷酸治疗乳腺癌的靶点；经干扰及过表达TROJAN实验结果显示，可抑制以及促进乳腺癌细胞体外迁移以及侵袭能力，下调TROJAN后可抑制乳腺癌细胞增殖能力；体内功能实验结果表明，干扰LTR70可降低小鼠原位脂肪垫成瘤能力以及肺转移成瘤能力；亲本乳腺癌细胞肺转移瘤模型干预实验结果表明，特异靶向LTR70的反义寡核苷酸治疗有效，且毒副作用小。所述的长末端重复序列LTR70及其包括的另外成员可用于制备靶向治疗乳腺癌的药物。

Application of Long Terminal Repeat Sequence LTR70 in the Preparation of Targeted Therapeutic Drugs for Breast Cancer

The invention belongs to the field of biotechnology and relates to the new use of long terminal repeat sequence LTR70 in pharmaceuticals. The invention provides long terminal repeat sequence LTR70 of human endogenous retrovirus as an antisense oligonucleotide target for the treatment of breast cancer. The experimental results of interference and overexpression of TROJAN show that it can inhibit and promote the migration and invasion of breast cancer cells in vitro, and downregulate TROJAN. It can inhibit the proliferation of breast cancer cells; in vivo functional experiments show that interfering with LTR70 can reduce the tumorigenicity of in situ fat pad and lung metastasis in mice; intervention experiments of parental breast cancer cell lung metastasis model show that the antisense oligonucleotide targeting LTR70 is effective and has little side effects. The long terminal repeat LTR70 and other members included in the LTR70 can be used to prepare drugs for targeted treatment of breast cancer.

【技术实现步骤摘要】
长末端重复序列LTR70在制备靶向治疗乳腺癌药物中的用途
本专利技术属于生物制药
，涉及长末端重复序列LTR70在制药中新的用途，具体涉及长末端重复序列LTR70在制备靶向治疗乳腺癌药物中的用途。
技术介绍
据报道，乳腺癌是现今中国乃至全世界女性发病率最高的肿瘤。2000年，多位学者提出乳腺癌分子分型概念，将乳腺癌按照基因表达情况分为腔面型、基底样型，人类表皮生长因子受体2过表达型以及正常样型。统计显示，尽管总体乳腺癌年死亡率逐年下降，但其中不同亚型间的预后相差甚远，其中，腔面型乳腺癌的激素受体阳性，对内分泌治疗较敏感，患者可获得较长的无病生存期；人类表皮生长因子受体2过表达的乳腺癌患者对曲妥珠单抗为代表的靶向治疗敏感，患者亦可从中获益；然而约占15-20％以免疫组化检测的三阴性乳腺癌(雌激素受体阴性，孕激素受体阴性以及人类表皮生长因子受体2阴性,TNBC)是一类异质性较强的肿瘤，在基因表达谱层面上与基底样型乳腺癌最为接近，由于其特定的生物学行为(恶性程度高，侵袭能力强)以及缺乏有效的靶向治疗药物，TNBC患者具有较高的短期复发转移风险以及较差的生存，其仍是临床治疗的一大挑战。研究显示，人内源性逆转录病毒(HERV)是人类进化过程中，由于感染逆转录病毒而整合至基因组中，序列约覆盖人类基因组的8％，占据700000余个基因座位置；HERV参与人类正常生理调控，同时，属于HERV的长末端重复序列(LTR)在肿瘤发生发展过程中起重要作用，因此，业内认为挖掘并验证乳腺癌中高表达的HERV，是其作为潜在的治疗靶点的理论基础。有研究公开了反义寡核苷酸(ASO)为与特定DNA或者RNA序列反向互补匹配并结合的短核苷酸片段，通过阻碍转录或者降解的方法，降低目的转录本表达；目前，以ASO为手段的治疗已具备广阔前景，有两种ASO药物被美国食品及药物管理局批准(其中，Fomivirsen用于治疗巨细胞病毒诱发视网膜炎；Mipomersen用于治疗家族性高胆固醇血症)，另有多个ASO正在进行临床试验；研究显示，与传统RNA干扰技术比较，ASO治疗有诸多优点，如：组织摄取率高；体内半衰期长；对细胞核内定位转录本降解能力强，等；ASO的应用使靶向细胞核内的非编码转录本作为治疗手段将成为现实。基于现有技术的现状，本申请的专利技术人拟提供新的靶向治疗乳腺癌药物，具体涉及ASO及其在制备靶向治疗乳腺癌药物中的用途。
技术实现思路
本专利技术的目的是基于现有技术的现状，针对现有技术存在的缺陷，提供新的靶向治疗乳腺癌药物，涉及长末端重复序列LTR70在制药中新的用途，具体涉及长末端重复序列LTR70在制备靶向治疗乳腺癌药物中的用途。本专利技术还公开了以人内源性逆转录病毒长末端重复序列LTR70相关转录本可作为反义寡核苷酸用于治疗乳腺癌的靶点。本专利技术中，所述的反义寡核苷酸指与特定DNA或者RNA序列反向互补匹配并结合的短核苷酸片段。本专利技术通过下述技术方案施现，首先借以转录组二代测序(RNA-Seq)，在配对乳腺癌与癌旁组织中，检测全基因组HERV转录层面表达水平，筛选出乳腺癌中高表达的HERV，本专利技术中，将其中差异表达倍数最高的LTR70的一个成员命名为TROJAN，具有序列1的结构，该TROJAN是一个在乳腺癌中高表达，并提示患者较差预后的HERV；本专利技术中，与TROJAN同源的LTR70的另外成员还包括序列2-10的长末端重复序列，该另外成员在乳腺癌中亦为高表达；本专利技术中，系列体外实验结果显示了TROJAN及其另外成员在乳腺癌细胞系中均为高表达，表明该TROJAN及其另外成员为乳腺癌广谱高表达HERV；该TROJAN及其另外成员可作为反义寡核苷酸用于治疗乳腺癌的靶点；干扰以及过表达TROJAN及其另外成员实验结果显示，可以抑制以及促进乳腺癌细胞体外迁移以及侵袭能力；下调TROJAN及其另外成员后亦可抑制乳腺癌细胞增殖能力，然而干扰TROJAN及其另外成员后对正常人乳腺上皮细胞增殖能力无明显抑制作用，该结果初步表明，以降解TROJAN及其另外成员为干预手段对人正常细胞毒副作用有限；继而通过一系列体内功能实验，例如BALB/c雌性裸小鼠原位脂肪垫接种乳腺癌细胞移植瘤模型，以及尾静脉注射乳腺癌细胞肺转移瘤模型，进一步证明干扰TROJAN及其另外成员可以降低小鼠原位脂肪垫成瘤能力以及肺转移成瘤能力；最后，在构建的亲本乳腺癌细胞肺转移瘤模型中，连续3周腹腔注射特异靶向TROJAN及其另外成员的ASO以及PBS对照后，ASO治疗组小鼠肺转移瘤生长速度明显放缓，小鼠肝、肾、脾器官指数以及血清肝肾功能指标均无明显变化，结果表明，特异靶向TROJAN及其另外成员的ASO治疗有效，且毒副作用小。本专利技术中，所述的TROJAN其核苷酸序列如序列1所示。本专利技术中，所述的另外成员其核苷酸序列如序列2--10序列所示。本专利技术提供了以人内源性逆转录病毒长末端重复序列LTR70相关转录本作为反义寡核苷酸用于治疗乳腺癌的靶点；干扰以及过表达实验结果显示，可以抑制以及促进乳腺癌细胞体外迁移以及侵袭能力，下调后亦可抑制乳腺癌细胞增殖能力；体内功能实验结果表明，干扰所述的末端重复序列LTR70可以降低小鼠原位脂肪垫成瘤能力以及肺转移成瘤能力；经亲本乳腺癌细胞肺转移瘤模型干预实验结果表明，特异靶向长末端重复序列LTR70的ASO治疗有效，且毒副作用小。所述的长末端重复序列LTR70可用于制备靶向治疗乳腺癌药物。本专利技术的长末端重复序列LTR70在制备靶向治疗乳腺癌药物中的用途具有以下特点：1、靶向乳腺癌治疗效果好，2、对正常组织毒副作用小，提供了新的针对乳腺癌，尤其是TNBC的潜在治疗措施。附图说明图1：(a)乳腺癌相关人内源性逆转录病毒(HERV)筛选流程；(b)潜在的51个乳腺癌相关HERV在8对乳腺癌与癌旁组织表达热图；(c)乳腺癌比癌旁组织差异表达倍数最高的5个HERV列表。图2：TROJAN的基本特征，其中，(a,b)快速cDNA末端扩增实验研究LTR70(TROJAN)全长转录本信息；(c)采用DNaseI处理后TROJAN表达情况；(d)TROJAN亚细胞定位情况；(e)TROJAN在多个细胞系中表达水平；(f)TROJAN在配对组织中表达验证；，(g)TROJAN高表达提示乳腺癌患者较差预后。图3：TROJAN参与调控乳腺癌进展，其中，(a)采用短发夹RNA(shRNA)干扰TROJAN后表达验证；(b)过表达TROJAN后表达验证；(c，d)干扰TROJAN后乳腺癌细胞体外迁移能力收到抑制；(e)过表达TROJAN后乳腺癌细胞体外迁移能力增加；(f)干扰TROJAN后乳腺癌细胞体外侵袭能力收到抑制；(g)尾静脉注射干扰TROJAN的乳腺癌细胞，萤光素酶成像图片以及定量结果；(h)尾静脉注射干扰TROJAN的乳腺癌细胞后小鼠肺转移结节定量；(i)干扰TROJAN后乳腺癌细胞体外增殖能力收到抑制；(j)裸鼠原位脂肪垫注射干扰TROJAN的乳腺癌细胞，肿瘤体积增长图以及21天后肿瘤解剖示意图。图4：TROJAN是乳腺癌治疗的潜在靶点，其中，(a)反义寡核苷酸(ASO)干扰效率验证；(b)ASO处理的乳腺癌细胞的体外增殖实验；(c)游离ASO摄取实验干扰效率验证；(d-k本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.长末端重复序列LTR70在制备靶向治疗乳腺癌药物中的用途；所述的长末端重复序列LTR70其核苷酸序列如序列1所示。

【技术特征摘要】
1.长末端重复序列LTR70在制备靶向治疗乳腺癌药物中的用途；所述的长末端重复序列LTR70其核苷酸序列如序列1所示。2.按权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的长末端重复序列还包括另外成员，所述另外成员其核苷酸序列如序列2--10序列所示。3.按权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的长末端重复序列的另外成员在制备靶向治疗乳腺癌药物中的用途。4.按权利要求1或3所述的用途，其特征在于，所述药物以人内源性逆转录病毒...

【专利技术属性】
技术研发人员：邵志敏，徐晓恩，金希，江一舟，狄根红，
申请(专利权)人：复旦大学附属肿瘤医院，
类型：发明
国别省市：上海,31