葡萄糖合成1,3-丙二醇的基因工程菌及其应用制造技术

本发明专利技术涉及葡萄糖合成1,3‑丙二醇的基因工程菌及其应用。该工程菌合成1,3‑丙二醇的途径为：葡萄糖在微生物自身糖酵解途径的作用下生成琥珀酰辅酶A；琥珀酰辅酶A在甲基丙二酰辅酶A变位酶的催化下生成甲基丙二酰辅酶A；甲基丙二酰辅酶A在甲基丙二酰辅酶A脱羧酶的催化下生成丙酰辅酶A；丙酰辅酶A在丙烯酰辅酶A还原酶的作用下生成丙烯酰辅酶A；丙烯酰辅酶A在3‑羟基丙酰基‑辅酶A脱水酶的作用下生成3‑羟基丙酰辅酶A；3‑羟基丙酰辅酶A在‑羟基丙酰辅酶A脱氢酶的作用下生成1,3‑丙二醇。该工程菌由表达盒转化合适的宿主生物体构成，该表达盒包含基因scpA、scpB、acuI‑E或acuI‑K和Msed。

GENETIC ENGINEERING BACTERIA FOR GLUCOSE SYNTHESIS OF 1,3-PROPYLENE GLYCOL AND ITS APPLICATION

The present invention relates to a genetically engineered strain of glucose synthesizing 1,3 -propanediol and its application. The pathways of synthesizing 1,3 propanediol by the engineering bacteria are as follows: glucose produces succinyl coenzyme A under the action of microbial self-glycolysis pathway; succinyl coenzyme A produces methylmalonyl coenzyme A under the catalysis of methylmalonyl coenzyme A mutase; methylmalonyl coenzyme A produces propionyl coenzyme A under the catalysis of methylmalonyl coenzyme A decarboxylase; propionyl coenzyme A reduces acrylyl coenz Acrylic coenzyme A is produced under the action of enzymes; 3 hydroxypropyl coenzyme A is produced under the action of 3 hydroxypropyl coenzyme A dehydratase; 3 hydroxypropyl coenzyme A is produced under the action of hydroxypropyl coenzyme A dehydrogenase to 1,3 propanediol. The engineering bacterium consists of an expression box transformed into a suitable host organism, which contains genes scpA, scpB, acuI_E or acuI_K and Messed.

【技术实现步骤摘要】
葡萄糖合成1,3-丙二醇的基因工程菌及其应用
本专利技术属于基因重组
，涉及葡萄糖合成1,3-丙二醇的基因工程菌及其应用。
技术介绍
1,3-丙二醇(1,3-PDO)是于上个世纪90年代初开发出来的一种重要二醇产品，主要被应用于印染和纺织品、工程塑料、涂料和油墨等领域，是PTT(polytrimethyleneterephthalate)聚酯纤维合成不可替代的重要原料。随着1,3PDO合成工艺不断创新和产能扩大，从1991年30美金/千克的工业售价降到现在1.7美金/千克。目前全球1,3-PDO产能为30万吨，还远远不能满足百万吨以上的市场需求，发展空间巨大。当前，1,3-PDO的生产方法主要分为化学法和生物法：化学法主要是丙烯醛法和环氧乙烷法，生物法主要是利用微生物发酵生产。目前微生物合成1,3-PDO主要有两条原料路线：一条是自然界中存在的，以Klebsiellapneumoniae(K.pneumoniae)菌、梭菌等微生物为代表直接将甘油转化为1,3-PDO的合成路线；另一条是葡萄糖为代表的非甘油原料转化路线。因为自然界中不存在将葡萄糖转化为1,3-PDO的天然微生物菌株，因此葡萄糖转化1,3-PDO的路线需要利用基因工程菌来完成。葡萄糖途径的基因工程菌构建方法主要分为途径整合策略和非天然途径的设计。因此，目前存在的问题是需要构建价廉高效的葡萄糖合成1,3-丙二醇的菌株。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是针对现有技术的不足提供葡萄糖合成1,3-丙二醇的基因工程菌。该工程菌通过将1,3-丙二醇合成酶基因导入E.coli菌株BL21(DE3)菌株中，构建1,3-丙二醇合成途径制成。该工程菌能够以含葡萄糖为底物通过发酵培养高效制备1,3-丙二醇。为此，本专利技术第一方面提供了一种葡萄糖合成1,3-丙二醇的基因工程菌，其合成1,3-丙二醇的途径如下：(1)葡萄糖在微生物自身糖酵解途径的作用下生成琥珀酰辅酶A；(2)琥珀酰辅酶A在甲基丙二酰辅酶A变位酶的催化下生成甲基丙二酰辅酶A；(3)甲基丙二酰辅酶A在甲基丙二酰辅酶A脱羧酶的催化下生成丙酰辅酶A；(4)丙酰辅酶A在丙烯酰辅酶A还原酶的作用下生成丙烯酰辅酶A；(5)丙烯酰辅酶A在3-羟基丙酰基-辅酶A脱水酶的作用下生成3-羟基丙酰辅酶A；(6)3-羟基丙酰辅酶A在-羟基丙酰辅酶A脱氢酶的作用下生成1,3-丙二醇。根据本专利技术的一些实施方式，所述基因工程菌由表达盒转化合适的宿主生物体构成，其中，所述表达盒含有至少一种以下基因：(a)甲基丙二酰辅酶A变位酶活性的基因scpA；(b)甲基丙二酰辅酶A脱羧酶活性的基因scpB；(c)丙烯酰辅酶A还原酶活性的基因acuI-E和/或acuI-K；(d)3-羟基丙酰辅酶A脱水酶活性的基因Msed。根据本专利技术的一些实时方式，当所述表达盒包含(a)-(d)中的三种以下的基因时，由此产生的转化后的宿主生物体含有表达盒所包含的相应的基因中的每种至少一个。在本专利技术的一些优选的实施例中，所述表达盒包含(a)-(d)所有基因。本专利技术中，所述合适宿主生物体包括大肠杆菌和/或克雷伯菌。本专利技术中，所述编码甲基丙二酰辅酶A变位酶活性的基因scpA的氨基酸序列包含如SEQ-No.1所示的氨基酸序列及基于该氨基酸序列的不引起所述丙烯酰辅酶A还原酶功能改变的氨基酸取代、缺失或加入。在本专利技术的一些实施例中，所述编码甲基丙二酰辅酶A变位酶活性的基因scpA的氨基酸序列为与SEQ-No.1的一致性为80％，优选为90％，进一步优选为95％，更进一步优选为99％，最优选为100％的氨基酸序列。本专利技术中，所述编码甲基丙二酰辅酶A脱羧酶活性的基因scpB的氨基酸序列包含如SEQ-No.2所示的氨基酸序列及基于该氨基酸序列的不引起所述丙烯酰辅酶A还原酶功能改变的氨基酸取代、缺失或加入。在本专利技术的一些实施例中，所述编码甲基丙二酰辅酶A脱羧酶活性的基因scpB的氨基酸序列为与SEQ-No.2的一致性为80％，优选为90％，进一步优选为95％，更进一步优选为99％，最优选为100％的氨基酸序列。本专利技术中，所述编码丙烯酰辅酶A还原酶活性的基因acuI-E的氨基酸序列包含如SEQ-No.3所示的氨基酸序列及基于该氨基酸序列的不引起所述丙烯酰辅酶A还原酶功能改变的氨基酸取代、缺失或加入。在本专利技术的一些实施例中，所述编码丙烯酰辅酶A还原酶活性的基因acuI-E的氨基酸序列为与SEQ-No.3的一致性为80％，优选为90％，进一步优选为95％，更进一步优选为99％，最优选为100％的氨基酸序列。本专利技术中，所述编码丙烯酰辅酶A还原酶活性的基因acuI-K的氨基酸序列包含如SEQ-No.4所示的氨基酸序列及基于该氨基酸序列的不引起所述丙烯酰辅酶A还原酶功能改变的氨基酸取代、缺失或加入。在本专利技术的一些实施例中，所述编码丙烯酰辅酶A还原酶活性的基因acuI-K的氨基酸序列为与SEQ-No.3的一致性为80％，优选为90％，进一步优选为95％，更进一步优选为99％，最优选为100％的氨基酸序列。本专利技术中，所述编码3-羟基丙酰辅酶A脱水酶活性的基因Msed的氨基酸序列包含如SEQ-No.5所示的氨基酸序列及基于该氨基酸序列的不引起所述丙烯酰辅酶A还原酶功能改变的氨基酸取代、缺失或加入。在本专利技术的一些实施例中，所述编码3-羟基丙酰辅酶A脱水酶活性的基因Msed的氨基酸序列为与SEQ-No.5的一致性为80％，优选为90％，进一步优选为95％，更进一步优选为99％，最优选为100％的氨基酸序列。本专利技术第二方面提供了本专利技术第一方面所述的基因工程菌在发酵糖类生产1,3-丙二醇中的应用。本专利技术将非天然代谢途径的设计和重构对于拓展菌株的代谢能力用于化学品的生产，通过分析1,3-丙二醇的合成机理，利用代谢途径反向合成的方法，建立“基因-蛋白-反应”对应关系，设计和挖掘葡萄糖生产1,3-丙二醇的新途径，葡萄糖经由succinyl-CoA(琥珀酰辅酶A)、propionyl-CoA(丙酰辅酶A)和3-hydroxypropyl-CoA(3-羟基丙酰辅酶A)，最终合成1,3-丙二醇。本专利技术实现了葡萄糖直接合成1,3-丙二醇，拓宽了1,3-丙二醇的合成路线。进一步地，本专利技术利用能够过表达甲基丙二酰辅酶A变位酶活性的基因scpA、甲基丙二酰辅酶A脱羧酶活性的基因scpB、丙烯酰辅酶A还原酶活性的基因acuI-E和/或基因acuI-K，并表达3-羟基丙酰辅酶A脱水酶活性的基因Msed的重组微生物在摇瓶中以葡萄糖为底物进行发酵培养获得1,3-丙二醇。本专利技术的重组微生物在发酵过程中可以利用廉价的葡萄糖为原料，可以显著降低生产成本，拓宽了1,3-丙二醇的合成路线，具有良好的市场应用前景。附图说明下面结合附图来对本专利技术作进一步详细说明：图1为本专利技术中的葡萄糖合成1,3-丙二醇的基因工程菌所具有的葡萄糖合成1,3-PDO途径示意图；图2示出1,3-PDO的LC-MS/MS检测结果；其中，图2A示出1,3-丙二醇标准品的出峰时间；图2B示出BL21-EAB-M重组菌株发酵培养产物的出峰时间；图2C示出对照菌株发酵培养产物的出峰时间。具体实施方式为使本专利技术更加容易理解，下面将结合附图和实施例来详细说明本专利技术，这本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种葡萄糖合成1,3‑丙二醇的基因工程菌，其合成1,3‑丙二醇的途径如下：(1)葡萄糖在微生物自身糖酵解途径的作用下生成琥珀酰辅酶A；(2)琥珀酰辅酶A在甲基丙二酰辅酶A变位酶的催化下生成甲基丙二酰辅酶A；(3)甲基丙二酰辅酶A在甲基丙二酰辅酶A脱羧酶的催化下生成丙酰辅酶A；(4)丙酰辅酶A在丙烯酰辅酶A还原酶的作用下生成丙烯酰辅酶A；(5)丙烯酰辅酶A在3‑羟基丙酰基‑辅酶A脱水酶的作用下生成3‑羟基丙酰辅酶A；(6)3‑羟基丙酰辅酶A在‑羟基丙酰辅酶A脱氢酶的作用下生成1,3‑丙二醇。

【技术特征摘要】
1.一种葡萄糖合成1,3-丙二醇的基因工程菌，其合成1,3-丙二醇的途径如下：(1)葡萄糖在微生物自身糖酵解途径的作用下生成琥珀酰辅酶A；(2)琥珀酰辅酶A在甲基丙二酰辅酶A变位酶的催化下生成甲基丙二酰辅酶A；(3)甲基丙二酰辅酶A在甲基丙二酰辅酶A脱羧酶的催化下生成丙酰辅酶A；(4)丙酰辅酶A在丙烯酰辅酶A还原酶的作用下生成丙烯酰辅酶A；(5)丙烯酰辅酶A在3-羟基丙酰基-辅酶A脱水酶的作用下生成3-羟基丙酰辅酶A；(6)3-羟基丙酰辅酶A在-羟基丙酰辅酶A脱氢酶的作用下生成1,3-丙二醇。2.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌由表达盒转化合适的宿主生物体构成，其中，所述表达盒含有至少一种以下基因：(a)甲基丙二酰辅酶A变位酶活性的基因scpA；(b)甲基丙二酰辅酶A脱羧酶活性的基因scpB；(c)丙烯酰辅酶A还原酶活性的基因acuI-E和/或acuI-K；(d)3-羟基丙酰辅酶A脱水酶活性的基因Msed。3.根据权利要求2所述的基因工程菌，其特征在于，当所述表达盒包含(a)-(d)中的三种以下的基因时，由此产生的转化后的宿主生物体含有表达盒所包含的相应的基因中的每种至少一个；优选地，所述表达盒包含(a)-(d)的所有基因。4.根据权利要求2或3所述的基因工程菌，其特征在于，所述合适宿主生物体包括大肠杆菌和/或克雷伯菌。5.根据权利要求2-4中任意一项所述的基因工程菌，其特征在于，所述编码甲基丙二酰辅酶A变位酶活性的基因scpA的氨基酸序列包含如SEQ-No.1所示的氨基酸序列及基于该氨基酸序列的不引起所述丙烯酰辅酶A还原酶功能改变的氨基酸取代、缺失或加入；优选地，所述编码甲基丙二酰辅酶A变位酶活性的基因scpA的氨基酸序列为与SEQ-No.1的一致性为80％，优选为90％，进一步优选为95％，更进一步优选为99％，最优选为100％的氨基酸序列。6.根据权利要求2-5中任意一项所述的基因工程菌，其特征在于，所述编码甲基丙二酰辅酶A脱羧酶活性的基因scpB的氨...

【专利技术属性】
技术研发人员：谭天伟，林珊珊，王梦，
申请(专利权)人：北京化工大学，
类型：发明
国别省市：北京,11