虎斑乌贼神经肽sCAP及其用途制造技术

本发明专利技术提供一种虎斑乌贼神经肽sCAP及其用途，属于神经肽技术领域，sCAP基因总长度为666bp的cDNA序列，包括109bp的5′‑UTR、296bp的3′‑UTR以及261bp的开放阅读框ORF，一共编码86个氨基酸，MW为9.3kDa，pI8.52。构建含有神经肽sCAP基因的载体，导入宿主菌rosetta后诱导表达，经扩大培养后收集重组蛋白即可应用于虎斑乌贼的生殖调控中。有益效果为：喂养或者喷洒含有虎斑乌贼sCAP基因重组蛋白溶液后，虎斑乌贼的活动能力、摄食能力、免疫能力更为优异，对虎斑乌贼养殖过程中的生殖调控应用具有指导意义。

Neuropeptide sCAP from Cupressus tigrifolia and its application

The present invention provides a neuropeptide sCAP and its application, belonging to the field of neuropeptide technology. The total length of sCAP gene is 666 bp, including 109 BP 5'UTR, 296 BP 3' UTR and 261 BP open reading frame ORF, encoding 86 amino acids, MW is 9.3 kDa, pI8.52. The vector containing neuropeptide sCAP gene was constructed and induced to express after being introduced into host strain rosetta. The recombinant protein collected after expanded culture could be used in reproductive regulation of cuttlefish. The beneficial effects were as follows: after feeding or spraying the recombinant protein solution containing the sCAP gene, the activity, feeding ability and immune ability of the squid were better, which had guiding significance for the reproductive regulation and application in the process of squid breeding.

【技术实现步骤摘要】
虎斑乌贼神经肽sCAP及其用途
本专利技术属于神经肽
，具体涉及虎斑乌贼神经肽sCAP及其用途。
技术介绍
目前关于头足类神经肽的研究主要集中在如GnRH、FaRPs和APGWamide等小分子多肽方面，而在生理调节过程中意义重大的小分子肽——sCAP研究较少。Lloyd等最早对软体动物中散大蜗牛的CAP的分布特征进行了鉴定。sCAP在刺激心脏运动、控制肌肉收缩、输卵管收缩、增强后肠收缩及生物蜕皮等生理过程中发挥着重要作用。在头足类中，sCAP最初发现于长蛸(Octopusminor)的脑组织中，有Ocp-1、Ocp-2、Ocp-3和Ocp-4四种类型。其相关类似物oct-SCPRP也被发现于真蛸中，具有收缩牙齿及舌头牵拉肌的作用。有研究表明Ocp-1和Ocp-2是非洲大蜗牛中Achatin-I的同源基因产物，Ocp-1可通过影响红螺(Rapanathomasiana)中谷氨酸含量刺激心脏收缩。本专利技术方法利用RACE(Rapid-amplificationofcDNAends)克隆获得虎斑乌贼sCAP(以下简称SpsCAP)全长序列并开展生物信息学分析，并用多种生物软件对该神经肽基因进行了生物学分析，采用qPCR技术研究sCAP基因在虎斑乌贼成熟的雌性个体和雄性个体不同组织中表达的差异性，进而推测sCAP基因在乌贼中的可能生理功能，并为虎斑乌贼的种质资源保护和开发奠定一定理论基础，为乌贼人工养殖和育种工作提供一定的理论支持。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供虎斑乌贼神经肽sCAP及其用途，运用分子生物学手段分析了虎斑乌贼神经肽的基因序列、基因的组织表达特异性，并对其在虎斑乌贼各组织中的特异表达位点进行了细胞定位，对虎斑乌贼的生殖活动具有较高的调控能力，为虎斑乌贼的种质资源保护和人工繁育提供一定的理论基础。本专利技术为实现上述目的所采取的技术方案为：一种虎斑乌贼神经肽sCAP，sCAP基因总长度为666bp的cDNA序列，其cDNA序列如SEQIDNO.1所示，包括109bp的5′-UTR、296bp的3′-UTR以及261bp的开放阅读框ORF，一共编码86个氨基酸，其序列如SEQIDNO.2所示，MW为9.3kDa，pI8.52。信号肽位于1号及20号氨基酸之间，该蛋白含有明显跨膜区结构，对该蛋白的二级结构分析发现，它含有33.72％的延伸链、66.28％的无规则卷曲结构，亲水性分析显示该蛋白中含有28个亲水性氨基酸和58个疏水性氨基酸，为亲水性蛋白。虎斑乌贼sCAP同源性氨基酸序列比对发现，虎斑乌贼与曼氏无针乌贼的相似度最高，其次是商乌贼；构建系统进化树分析发现，虎斑乌贼sCAP基因的进化关系与曼氏无针乌贼以及商乌贼最近，并且与软体动物聚为一类。通过qPCR表达分析，虎斑乌贼sCAP基因的表达在雄性及雌性虎斑乌贼的视叶中被明显检测到，其次是脑，表明sCAP通过控制虎斑乌贼的神经系统来控制其活动。sCAP在缠卵腺及副缠卵腺中微量表达说明其可能与输卵管的收缩功能有关。从表达量分析，雄性个体的表达量明显高于雌性个体，表达量最显著的视叶组织雄性的表达量与雌性之间也有显著性差异，并且雄性乌贼与雌性乌贼在视叶组织的相对表达量相差4倍，可能是因为不同性别的组织差异性导致的，推测该基因在控制雌雄个体生理活动时可能存在性别差异，还需进一步实验验证。虎斑乌贼sCAP基因的成功克隆以及组织表达特异性分析对于sCAP基因在虎斑乌贼细胞中的定位以及生理功能验证研究提供理论依据，并为虎斑乌贼的种质资源保护与开发奠定一定的理论基础。同时可为虎斑乌贼神经肽sCAP在虎斑乌贼养殖过程中的生殖调控应用提供理论依据。本专利技术还提供一种虎斑乌贼神经肽sCAP在头足类养殖过程的生殖调控中的应用，具体包括：(一)重组表达载体的构建、鉴定：重组质粒的构建与鉴定：根据虎斑乌贼神经肽sCAP的cDNA序列，利用一对特异引物P1和P2扩增虎斑乌贼神经肽sCAP的编码序列。在P1引物(序列如SEQIDNO.3所示)的5＇端引入限制性内切酶位点KpnI和编码肠激酶酶切位点的序列，在P2引物(序列如SEQIDNO.4所示)的5′端引入限制性内切酶位点SacI和终止密码子编码序列TCA，两个引物序列分别为：P1：GGTACCGACGATCCTTGTAATCCGTTACGGATCTGTCCTCTCTGC；P2：GAGCTCTCATTTTCCAGTAATTCCAACGGGTTGTAGTTG；PCR反应体积为20μl，扩增条件：95℃5min；95℃30s，65℃30s，73℃30s共35个循环；71℃7min。PCR产物经琼脂糖电泳检测后，对目标产物片段回收并与pMD19-T载体进行TA克隆连接，转化Trans5α并在LB(Amp+)平板培养。经菌落PCR反应挑取克隆，测序确定阳性克隆并提取质粒。将该质粒与pET32a(+)质粒均用KpnI和SacI双酶切后，分别回收酶切产物，并进行T4DNA连接酶连接，得到成功导入含有目的基因的虎斑乌贼神经肽的载体。(二)重组表达虎斑乌贼神经肽sCAP基因的表达：1)重组蛋白的诱导表达：将上述得到的重组载体导入宿主菌rosetta，用含120μg/mL的氨苄青霉素、42ug/mL氯霉素以及8μg/mL氯苄苷的LB培养基进行扩大培养，以P1、P2为引物进行PCR反应，筛选转化入正确的重组表达载体的工程菌株并进行测序验证没有碱基突变的发生，通过在LB培养基中添加μg/mL量级的氯苄苷，可有效降低化学刺激和生物刺激对碱基突变的诱导刺激作用，提高未突变工程菌株的占比，从而使得重组蛋白得到高效地诱导表达。2)重组表达神经肽工程菌的扩大培养与收集：选取工程菌进行37℃培养过夜活化。将活化菌以1:50接种于3.95L的2×YT培养液中(含120ug/mL的氨苄青霉素与42ug/mL氯霉素)37℃震荡培养，当OD600为0.5时加丙基硫代半乳糖苷至终浓度1mM，37℃诱导表达2h，菌液经5,000rmp离心30min收集细胞。将收集的细胞进行真空冷冻干燥机除净水分以杀死工程菌，收集工程菌制品，诱导2小时后重组蛋白的表达效率约为26.55％，将得到的冻干粉剂溶解于灭菌海水中，制成重组蛋白浓度约为10mg/mL的母液。(三)产重组神经肽工程菌在制备饲料添加剂上的应用：所述头足类选用虎斑乌贼或者曼氏无针乌贼，将饲喂虎斑乌贼的饲料中按照每100g饲料中以喷洒的方式加入15～50mg重组蛋白母液，添加时，取母液用海水稀释10～20倍后均匀喷洒在饲料上，待饲料完全晾干后再行饲喂；或者按每平方虎斑乌贼的养殖水水面喷洒10～15mg上述重组蛋白母液。饲喂后，虎斑乌贼的活动能力、摄食能力、免疫能力更为优异，能够较快达到性成熟，而且虎斑乌贼神经肽sCAP在雄性虎斑乌贼中的效果较雌性虎斑乌贼更为明显。虎斑乌贼sCAP基因的成功克隆以及组织表达特异性分析对于sCAP基因在虎斑乌贼细胞中的定位以及生理功能验证研究提供理论依据，并为虎斑乌贼的种质资源保护与开发奠定一定的理论基础。同时基于虎斑乌贼神经肽sCAP基因重组得到的重组蛋白在虎斑乌贼养殖过程中的生殖调控应用中具有重要的意义。本专利技术的有益效果为：虎斑乌贼sCAP基因的成功克隆以及组织表达特异性分析对于sC本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.虎斑乌贼神经肽sCAP，其特征在于，虎斑乌贼神经肽sCAP包含有：1)氨基酸序列为SEQ ID NO.2的多肽；2)在1)的多肽上进行取代、缺失、添加一个或几个氨基酸，且具有1)中多肽功能的多肽。

【技术特征摘要】
1.虎斑乌贼神经肽sCAP，其特征在于，虎斑乌贼神经肽sCAP包含有：1)氨基酸序列为SEQIDNO.2的多肽；2)在1)的多肽上进行取代、缺失、添加一个或几个氨基酸，且具有1)中多肽功能的多肽。2.一种基因，其特征在于，所述的基因编码权利要求1所述的虎斑乌贼神经肽。3.如权利要求2所述的基因，其特征在于：所述基因的核苷酸序列为SEQIDNO.1。4.一种重组表达载体，其特征在于，所述的表达载体中插入了用于重组表达权利要求1所述的虎斑乌贼神经肽的全部或部分片段。5.如权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于，所述的表达载体为pMD19-T载体。6.如权利要求1-5任一项所述的虎斑乌贼神经肽sCAP在头足类养殖过程中对于生殖调控的用途。7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于：所述头足类为虎斑乌贼...

【专利技术属性】
技术研发人员：迟长凤，李颖，黄伟，刘慧慧，吕振明，
申请(专利权)人：浙江海洋大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33