人皮肤细胞生长因子的纳米粒脂质体的制备方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种人皮肤细胞生长因子的纳米粒脂质体的制备方法及其应用，本发明专利技术采用乙醇注入法制备包裹人皮肤细胞生长因子的纳米脂质体，利用其纳米制剂效应与脂质体的生物相容性特点，可显著提高皮肤吸收滞留的效率，促进其疗效的充分发挥，提高了皮肤细胞生长因子在活体或者细胞中的作用效果。该方法操作简单，封装效率高，人皮肤细胞生长因子可以被容易地递送到活体皮肤创伤内层或需美容皮肤深层细胞中，同时保持人皮肤细胞生长因子具有高的生理活性。

Preparation and application of nanoparticle liposomes containing human skin growth factor

The invention discloses a preparation method and application of a nanoparticle liposome for human skin growth factor. The nanoparticle liposome encapsulating human skin growth factor is prepared by ethanol injection method. By utilizing the biocompatibility characteristics of the nanoparticle preparation effect and the liposome, the absorption and retention efficiency of the skin can be significantly improved, the full play of the curative effect can be promoted, and the skin can be improved. The effect of dermal growth factor in vivo or in cells. The method is simple to operate and has high encapsulation efficiency. Human skin growth factor can be easily delivered to the inner layer of living skin trauma or deep cells of skin requiring cosmetology, while maintaining high physiological activity of human skin growth factor.

【技术实现步骤摘要】
人皮肤细胞生长因子的纳米粒脂质体的制备方法及应用
本专利技术涉及一种人皮肤细胞生长因子的纳米粒脂质体的制备方法及其应用，属于生物医学领域。
技术介绍
英国学者Bangham和Standish在1961年通过电镜发现当磷脂分子分散在水中时会自然形成有序排列的类似生物膜结构的多层囊泡。后来，人们将这种具有双层膜形态的生物膜结构的中空小球通称为脂质体。随着近年来生物技术的发展，人们已研究出各种不同类型的脂质体，如阳离子脂质体、前体脂质体、长循环脂质体等。脂质体技术已广泛的应用到制药、生物、遗传、化工、食品等各个领域。固体脂质纳米粒(Solidlipidnanoparticles,SLN)是20世纪90年代初发展起来的新一代亚微粒给药系统，是指粒径在10～1000nm，以固态天然或合成的类脂如卵磷脂、三酰甘油等为载体，将药物包裹或夹嵌于类脂核中制成的固体胶粒给药系统，以毒性低、生物相容性好、生物可降解的固态天然或合成的类脂为载体，将药物吸附或包裹于脂质膜中制成的新一代纳米粒给药系统。采用脂质体包埋可以很好地解决渗透性低这一问题，它制备工艺简单，且粒径小，冻干成粉后便于运输和使用，具有广泛的应用前景。纳米颗粒脂质体(Nanoliposomes)是粒径为10-100nm的单室脂质体，其不仅具有脂质体的良好性质，还在稳定性、吸收和体内分布等方面呈现纳米效应，因此在药物制剂领域有着广泛的应用前景，是纳米药物载体研究的新途径。人皮肤细胞生长因子是在人体内存在的一类细胞生长因子，它的主要功能是促进皮肤细胞的分裂、增殖和分化，从而以新生的细胞代替衰老和死亡的细胞。研究表明：极微量的细胞生长因子即能强烈刺激细胞生长，抑制衰老基因表达，阻止皮肤衰老，使皮肤各组成成份保持最佳生理状态。此外，它还能刺激细胞外一些大分子(如透明质酸和胶原蛋白等)的合成与分泌，滋润皮肤，是决定皮肤活力和健康的关键因素。另有研究发现人皮肤细胞生长因子具有加速皮肤和粘膜创伤愈合，消炎镇痛，防止溃疡的功效。但由于人皮肤细胞生长因子稳定性差，并且对温度和pH等敏感，极易失活，其还有分子量大不易透皮等缺点，极大地限制了其在临床方面的应用。
技术实现思路
本专利技术克服了上述现有技术的不足，揭示一种人皮肤细胞生长因子的纳米粒脂质体的制备方法及其应用。采用创新纳米脂质体技术，将人皮肤细胞生长因子包裹在纳米脂质体里面，利用其纳米制剂效应与脂质体的生物相容性特点，可显著提高皮肤吸收滞留的效率，促进其疗效的充分发挥，可以开发为具有促进创面愈合作用的医疗器械产品和有美容护肤作用的高端化妆品。该新型包裹人皮肤细胞生长因子的纳米脂质体的制备方法是乙醇注入法，此方法操作简单，封装人皮肤细胞生长因子的效率高，人皮肤细胞生长因子可以被容易地递送到活体皮肤创伤内层或需美容皮肤深层细胞中，同时保持人皮肤细胞生长因子具有高的生理活性，进而使人皮肤细胞生长因子在活体或细胞中发挥高效的作用。一种人皮肤细胞生长因子纳米粒脂质体的制备方法，包括以下步骤：1)人皮肤细胞的分离：利用人皮肤原始样本分离获得人的原代皮肤细胞；2)人皮肤细胞生长因子的制备：将步骤1)中获得的原代皮肤细胞进行培养、传代，收集皮肤细胞的细胞培养液，经过清洗、酶消化、中和、离心后即可获得人皮肤细胞生长因子；3)人皮肤细胞生长因子的纳米粒脂质体的制备：通过乙醇注入法利用纳米颗粒脂质体直接包埋步骤2)所获得的人皮肤细胞生长因子，获得人皮肤细胞生长因子的纳米粒脂质体。上述制备方法中步骤1)中所述的人皮肤细胞的分离，包括如下步骤：S1收集人皮肤原始样本并去除皮下脂肪并称重，消毒后将皮肤组织切成糜状；S2将步骤S1中糜状皮肤组织转入含有终浓度2.5mg/mlCollagenase和2.5mg/mlDispase混合酶液的离心管中，消化成组织均浆液a；S3在步骤S2所获得的组织匀浆液a和0.25％胰酶以体积比为4:1比例混合，继续消化，获得组织匀浆液b；S4在步骤S3中获得的组织匀浆液b中加入10mg/ml的DNA酶(1g成人组织加100μl)持续消化，获得组织消化液；S5在步骤S4中获得组织消化液和含有10％FBS的DMEM以1:1体积比混合进行中和，将中和后的消化液用细胞过滤器过滤，获得细胞悬液；S6将细胞悬液两次离心去上清液所获得的沉淀即为分离得到的成人的原代皮肤细胞。上述制备方法中的步骤2)所述的人皮肤细胞生长因子的制备，包括以下步骤：SS1使用步骤1)中获得原代皮肤细胞进行细胞培养，细胞密度达到80％时进行细胞传代培养，获得皮肤细胞培养液；SS2收集SS1中获得的皮肤细胞培养液，使用5-10ml的PBS清洗去除残留的培养基，以体积比为25:1的比例和TrypLEExpress(1×)混合进行消化，获得皮肤细胞消化液；SS3步骤SS2中获得的皮肤细胞消化液中的细胞全部脱离后以1:1体积比和含有5％FBS的DMEM混合进行中和，获得中和的细胞悬液；SS4步骤SS3中获得的中和的细胞悬液离心去上清液获得皮肤细胞；SS5步骤SS5中的皮肤细胞使用皮肤细胞生长因子培养基培养，待培养基变黄时换液，回收皮肤细胞因子培养基；SS6将SS5回收的皮肤细胞因子培养基离心收集上清液，收集到的上清液过滤除菌，即可获得皮肤细胞生长因子。上述制备方法中的步骤3)所述的人皮肤细胞生长因子的纳米粒脂质体的制备，包括以下步骤：SSS1称量大豆卵磷脂8-10g，加入50-60ml无水乙醇和40-50ml双蒸水，搅拌后过滤，获得空白脂质体溶液；SSS2将80-100ml的人皮肤细胞生长因子溶解于80-100ml双蒸水中，获得人皮肤细胞生长因子双蒸水溶液；SSS3将步骤S2获得的人皮肤细胞生长因子双蒸水溶液以8-10滴/min的速度缓慢加入到步骤S1获得的空白脂质体溶液中，搅拌获得人皮肤细胞生长因子稀脂质体；SSS4将步骤S3制备的人皮肤细胞生长因子稀脂质体注入超滤膜包中，除去游离的人皮肤细胞生长因子、空白脂质体和乙醇，获得人皮肤细胞生长因子浓脂质体悬液。上述人皮肤细胞生长因子的纳米粒脂质体的制备中的步骤SSS4中获得的人皮肤细胞生长因子浓脂质体悬液可直接分装和/或经过冻干工艺制备成固体成品。上述制备方法所获得的人皮肤细胞生长因子的纳米粒脂质体在皮肤创伤愈合中的应用。上述制备方法所获得的人皮肤细胞生长因子的纳米粒脂质体在化妆品中的应用。有益效果：(1)本专利技术采用乙醇注入法制备包裹人皮肤细胞生长因子的纳米脂质体，此方法操作简单，封装人皮肤细胞生长因子的效率高，人皮肤细胞生长因子可以被容易地递送到活体皮肤创伤内层或需美容皮肤深层细胞中，同时保持人皮肤细胞生长因子具有高的生理活性，进而使人皮肤细胞生长因子在活体或细胞中发挥高效的作用。(2)本专利技术采用项目组的创新纳米脂质体技术平台，将人皮肤细胞生长因子包裹在纳米脂质体里面，利用纳米制剂效应和脂质体的生物相容性特点，可显著提高皮肤吸收滞留效率，促进其疗效的充分发挥，可开发为具有促进创面愈合作用的医疗器械产品和美容护肤作用的高端化妆品。附图说明图1为磷脂的极性基团和非极性长链结构示意图。图2为脂质体结构模型图。图3为不同溶解性药物在脂质体中的分布示意图。图4为纳米颗粒脂质体悬浮液状态。图5为纳米颗粒脂质体冻干粉状态。图6人皮肤本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种人皮肤细胞生长因子纳米粒脂质体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1)人皮肤细胞的分离：利用人皮肤原始样本分离获得人的原代皮肤细胞；2)人皮肤细胞生长因子的制备：将步骤1)中获得的原代皮肤细胞进行培养、传代，收集皮肤细胞的细胞培养液，经过清洗、酶消化、中和、离心后即可获得人皮肤细胞生长因子；3)人皮肤细胞生长因子的纳米粒脂质体的制备：通过乙醇注入法利用纳米颗粒脂质体直接包埋步骤2)所获得的人皮肤细胞生长因子，获得人皮肤细胞生长因子的纳米粒脂质体。

【技术特征摘要】
1.一种人皮肤细胞生长因子纳米粒脂质体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1)人皮肤细胞的分离：利用人皮肤原始样本分离获得人的原代皮肤细胞；2)人皮肤细胞生长因子的制备：将步骤1)中获得的原代皮肤细胞进行培养、传代，收集皮肤细胞的细胞培养液，经过清洗、酶消化、中和、离心后即可获得人皮肤细胞生长因子；3)人皮肤细胞生长因子的纳米粒脂质体的制备：通过乙醇注入法利用纳米颗粒脂质体直接包埋步骤2)所获得的人皮肤细胞生长因子，获得人皮肤细胞生长因子的纳米粒脂质体。2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1)中的人皮肤细胞的分离包括如下步骤：S1：收集人皮肤原始样本并去除皮下脂肪并称重，消毒后将皮肤组织切成糜状；S2：将步骤S1中糜状皮肤组织转入含有终浓度2.5mg/mlCollagenase和2.5mg/mlDispase混合酶液的离心管中，消化成组织均浆液a；S3：在步骤S2所获得的组织匀浆液a和0.25％胰酶以体积比为4:1比例混合，继续消化，获得组织匀浆液b；S4：在步骤S3中获得的组织匀浆液b中加入10mg/ml的DNA酶持续消化，获得组织消化液；S5：在步骤S4中获得组织消化液和含有10％FBS的DMEM以1:1体积比混合进行中和，将中和后的消化液用细胞过滤器过滤，获得细胞悬液；S6：将细胞悬液两次离心去上清液所获得的沉淀即为分离得到的成人的原代皮肤细胞。3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2)人皮肤细胞生长因子的制备包括以下步骤：SS1：使用步骤1)中获得原代皮肤细胞进行细胞培养，细胞密度达到80％时进行细胞传代培养，获得皮肤细胞培养液；SS2：收集SS1中获得的皮肤细胞培养液，使用PBS清洗去除残留的...

【专利技术属性】
技术研发人员：张群，王杰，邢志青，吴训伟，李霄，张甜甜，张平，
申请(专利权)人：济南磐升生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37