茶花粉分离蛋白的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种茶花粉分离蛋白的制备方法，包括以下步骤：(1)取茶花粉，脱脂处理；(2)取步骤(1)脱脂茶花粉，破壁处理得到花粉溶液；(3)向步骤(2)得到的花粉溶液中，加入去离子水调整固液比为1:20‑80，调节pH至7.5‑12，恒温搅拌，离心取上清液；(4)调节步骤(3)收集的上清液pH至3.0‑5.0，离心分离出蛋白，洗涤后将蛋白液pH调至7.0，冷冻干燥得茶花粉蛋白。本发明专利技术制备方法采用多种破壁工艺，提高了蛋白质的得率，其中通过考查和比较蛋白质得率和蛋白质水解度，酶解‑超声复合破壁工艺效果最好；本发明专利技术制备所得茶花粉蛋白经过模拟胃肠道消化后所获得的水解物具有抗疲劳抗氧化的活性。

Preparation of Camellia Pollen Isolated Protein

The invention discloses a preparation method of tea pollen isolate protein, which comprises the following steps: (1) taking tea pollen and degreasing treatment; (2) taking steps: (1) degreasing tea pollen and wall breaking treatment to obtain pollen solution; (3) adding deionized water to the pollen solution obtained by step (2) adjusting the solid-liquid ratio to 1:20_80, adjusting the pH to 7.5_12, stirring at constant temperature, centrifuging the supernatant; (4) adjusting steps (3) The supernatant was collected at pH of 3.0 5.0. Protein was separated by centrifugation. After washing, the pH of protein solution was adjusted to 7.0. Tea pollen protein was obtained by freeze-drying. The preparation method of the invention adopts various wall-breaking processes to improve the protein yield, in which enzymatic hydrolysis and ultrasound combined wall-breaking process has the best effect by examining and comparing the protein yield and protein hydrolysis degree; the hydrolysate obtained by the tea pollen protein prepared by the invention after simulated gastrointestinal digestion has anti-fatigue and anti-oxidation activity.

【技术实现步骤摘要】
茶花粉分离蛋白的制备方法
本专利技术属于茶花粉的分离提取技术，特别是涉及一种茶花粉分离蛋白的制备方法。
技术介绍
茶花粉是指蜜蜂从茶树花药内采集的花粉球，每年的9-11月是其生产时期，茶花粉多产于浙江、安徽、江苏、等地。新鲜的茶花粉具有特殊的茶香气息，尝起来味道略有些甜，其花粉颗粒大多呈橘红色。茶花粉具有提高人体免疫力、保护心脏降血压、抗老防衰等功效。其中含有丰富的蛋白质、不饱和脂肪酸、黄酮、多酚、多糖等活性物质。其中花粉蛋白质含量尤其丰富，一般平均含量在20％左右。花粉具有特殊的细胞壁，其外壁较为坚硬，孢粉素、纤维素和花粉素等致密物质构成了花粉壁，其存在不仅可以抵抗极高的温度和极大的压力、还可以耐腐蚀，对于物理、化学及酶的降解都较稳定。这层花粉壁极为坚硬，所以在制备花粉分离蛋白的时候，需采用破壁处理。目前国内外较常见的破壁方法主要有物理破壁和生物破壁法。而关于破壁方法对所制备的蛋白质的分子量和消化吸收率的影响未见报道。并且未见关于茶花粉分离蛋白的制备相关报道。
技术实现思路
专利技术目的：针对上述现有技术的缺陷，本专利技术提供了一种能够获得更易于消化吸收的茶花粉分离蛋白的茶花粉分离蛋白的制备方法。技术方案：本专利技术所述的一种茶花粉分离蛋白的制备方法，包括以下步骤：(1)取茶花粉，脱脂处理；(2)取步骤(1)脱脂茶花粉，破壁处理得到花粉溶液；(3)向步骤(2)得到的花粉溶液中，加入去离子水调整固液比为1:20-80，调节pH至7.5-12，恒温搅拌，离心取上清液；(4)调节步骤(3)收集的上清液pH至3.0-5.0，离心分离出蛋白，洗涤后将蛋白液pH调至7.0，冷冻干燥得茶花粉蛋白。步骤(1)中，所述茶花粉置于索氏提取器脱脂，脱脂溶剂为石油醚(30-60沸程)，虹吸2-3次后，取出得到的脱脂花粉。步骤(2)中，所述破壁处理采用超声波破壁处理、温差破壁处理和酶解破壁处理中的一种或者多种方式进行。复合破壁包括温差-超声、酶解-超声等方式。进一步的，所述超声波破壁处理是指：取脱脂茶花粉，以1：6-16(g/mL)固液比分散在去离子水中，搅拌溶解，然后使用超声波细胞粉碎机对其进行处理；超声波细胞粉碎机处理条件为：超声强度200-600w，超声时间5-40分钟，超声开时间0-5秒，超声关时间0-5秒。进一步的，所述温差破壁处理是指：取脱脂茶花粉，放于零下4-零下80℃冷冻0-48h，然后以料液比1：6-16(g/mL)加入50-100℃热水，搅拌溶解，然后放入25-90℃水浴锅里水浴1-12h。进一步的，所述酶解破壁处理是指：取脱脂茶花粉，以1：6-16(g/mL)固液比分散在去离子水中，搅拌溶解，调整pH为2.0-6.0，加入复合酶，25-65℃酶解，酶解完成后放入60-100℃水浴锅中2-20分钟使酶失活。其中，所述复合酶组成为纤维素酶、果胶酶、木聚糖酶和木瓜蛋白酶。优选的，所述复合酶总的加入量为100g花粉蛋白添加1.2g复合酶，即1.2％；各种酶的配比是纤维素酶:果胶酶:木聚糖酶:木瓜蛋白酶＝4:2:1:3。进一步的，所述温差-超声复合破壁是指：经过温差破壁处理后的花粉溶液，使用超声波细胞粉碎机对其继续进行处理；超声波细胞粉碎机处理条件为：超声强度200-600w，超声时间5-40分钟，超声开时间0-5秒，超声关时间0-5秒。进一步的，所述酶解-超声复合破壁是指：经过酶解破壁处理后的花粉溶液，使用超声波细胞粉碎机对其继续进行处理；超声波细胞粉碎机处理条件为：超声强度200-600w，超声时间5-40分钟，超声开时间0-5秒，超声关时间0-5秒。本申请优选酶解-超声复合破壁处理方式。步骤(3)中，采用0.1-1mol/L的NaOH溶液调节pH至7.5-12。步骤(3)中，所述恒温搅拌是指在25-75℃的恒温水浴锅中搅拌10-100分钟。步骤(3)中，所述离心是指用离心机以2500-5000rpm/min的转速离心5-30分钟。步骤(4)中，用0.1-1mol/L盐酸把pH调至3.0-5.0。步骤(4)中，所述离心是指以2500-5000rpm/min离心5-30分钟。步骤(4)中，离心分离出蛋白，用去离子水洗涤1-5次。步骤(4)中，所得蛋白液用0.1-1mol/L的NaOH把pH调至7.0。本申请中所述固液比单位均为g/mL。本专利技术制备方法的破壁处理，主要采用超声波处理、温差处理以及复合酶解处理，然后采用等电点沉淀法制备茶花粉分离蛋白。制备所得茶花粉分离蛋白为黄色粉末，蛋白质含量>90％，水分含量<10％，碳水化合物<0.5％；消化吸收率高，分子量没有变化。有益效果：相比较于现有技术，本专利技术制备方法采用多种破壁工艺，提高了蛋白质的得率，其中通过考查和比较蛋白质得率和蛋白质水解度，酶解-超声复合破壁工艺效果最好；本专利技术制备所得茶花粉蛋白经过模拟胃肠道消化后所获得的水解物具有抗疲劳抗氧化的活性。附图说明图1是不同破壁方式对茶花粉细胞壁结构的影响；图2是不同破壁方式对茶花粉蛋白质得率的影响；图3是不同破壁方式对茶花粉蛋白质分子量的影响；图4是不同破壁方式对茶花粉细胞壁结构的影响。其中，Control表示对照组(未破壁花粉)，U表示超声破壁，T表示温差破壁，E表示酶解破壁，T+U表示温差-超声复合破壁，E+U表示酶解-超声复合破壁。具体实施方式下面结合具体实施例对本申请作出详细说明。原料来源：茶花粉——购自新疆新源养蜂合作社。纤维素酶、果胶酶、木聚糖酶、木瓜蛋白酶购自上海源叶生物科技有限公司。人脐静脉内皮细胞(HUVEC)购自南京博全科技有限公司。实施例1一种茶花粉分离蛋白的制备方法，包括以下步骤：(1)花粉脱脂处理；取茶花粉，放入索氏提取器中，加入石油醚，回流2次；(2)花粉超声波破壁处理：取步骤(1)得到的脱脂茶花粉，以1:12(g/mL)固液比分散在去离子水中，搅拌使花粉溶液完全溶解，然后使用超声波细胞粉碎机对其进行处理，设置超声强度400w，超声时间20分钟，超声开时间2s，超声关时间2s；(3)花粉分离蛋白的制备：破壁处理后的花粉溶液加入去离子水加至1：40的料水比，用NaOH溶液调节pH至10，在55℃的恒温水浴锅中搅拌80分钟，用离心机以3000rpm/min的转速离心10分钟并取出上清液；所得上清液用盐酸把pH调至4.0，再用离心机3000rpm/min离心10分钟，分离出蛋白，并且用去离子水洗涤两次，所得蛋白液用NaOH把pH调至7.0，冷冻干燥后得茶花粉蛋白。实施例2一种茶花粉分离蛋白的制备方法，步骤(2)为：花粉温差破壁处理：取脱脂茶花粉，放入-20℃冰箱中冷冻24h，然后以料液比1:12(g/mL)加入80℃热水，搅拌使花粉溶解，放入45℃水浴锅里水浴7h。其余操作同实施例1。实施例3一种茶花粉分离蛋白的制备方法，步骤(2)为：花粉酶解破壁处理：取脱脂茶花粉，以1:12(g/mL)固液比分散在去离子水中，搅拌使花粉溶解，在pH4.0加入复合酶1.2％，酶解温度45℃，复合酶配比为纤维素酶:果胶酶:木聚糖酶:木瓜蛋白酶＝4:2:1:3，放入水浴锅中酶解6h。酶解完成后放入80℃水浴锅中10分钟使酶失活。其余操作同实施例1。实施例4一种茶花粉分离蛋白的制备方法，步骤(2)为：花本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种茶花粉分离蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)取茶花粉，脱脂处理；(2)取步骤(1)脱脂茶花粉，破壁处理得到花粉溶液；(3)向步骤(2)得到的花粉溶液中，加入去离子水调整固液比为1:20‑80，调节pH至7.5‑12，恒温搅拌，离心取上清液；(4)调节步骤(3)收集的上清液pH至3.0‑5.0，离心分离出蛋白，洗涤后将蛋白液pH调至7.0，冷冻干燥得茶花粉蛋白。

【技术特征摘要】
1.一种茶花粉分离蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)取茶花粉，脱脂处理；(2)取步骤(1)脱脂茶花粉，破壁处理得到花粉溶液；(3)向步骤(2)得到的花粉溶液中，加入去离子水调整固液比为1:20-80，调节pH至7.5-12，恒温搅拌，离心取上清液；(4)调节步骤(3)收集的上清液pH至3.0-5.0，离心分离出蛋白，洗涤后将蛋白液pH调至7.0，冷冻干燥得茶花粉蛋白。2.根据权利要求1所述的茶花粉分离蛋白的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述破壁处理采用超声波破壁处理、温差破壁处理和酶解破壁处理中的一种或者多种方式进行。3.根据权利要求2所述的茶花粉分离蛋白的制备方法，其特征在于，所述破壁处理采用酶解-超声复合破壁处理。4.根据权利要求2所述的茶花粉分离蛋白的制备方法，其特征在于，所述超声波破壁处理是指：取茶花粉，以1：6-16固液比分散在去离子水中，搅拌溶解，然后使用超声波细胞粉碎机对其进行处理；超声波细胞粉碎机处理条件为：超声强度200-600w，超声时间5-40分钟，超声开时间0-5秒，超声关时间0-5秒。5.根据权...

【专利技术属性】
技术研发人员：李璇，薛峰，王身艳，王娟红，王艺，方诗文，朱昕仪，孙鲁宁，
申请(专利权)人：南京中医药大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32