一种高通量检测圣草酚的方法技术

本发明专利技术公开了一种高通量检测圣草酚的方法，属于合成生物技术领域。本发明专利技术使用的显色剂为氢氧化钠或者氢氧化钾，经显色处理后，圣草酚呈现紫色，浓度越高，紫色越深，且显色越快，静置时间越长，颜色也会加深，一般5min内反应完毕，即便在干扰物质柚皮素存在时依然可以直接用目视法选择高产菌株。该反应液也可以使用酶标仪做进一步检测。在水溶液中，建议使用NaOH处理，最佳检测波长为550‑580nm，在无色的合成培养基中建议使用KOH处理，最佳检测波长为560‑570nm。该方法简便高效，抗干扰，精准度高，时间和人力成本低，适用于高通量筛选圣草酚高产菌株。

【技术实现步骤摘要】
一种高通量检测圣草酚的方法
本专利技术涉及一种高通量检测圣草酚的方法，属于合成生物

技术介绍
圣草酚是经由柚皮素在3’位羟基化后合成的，是重要的保健品。圣草酚多从植物中提取，产量低，价格较高。而微生物合成时，催化柚皮素合成圣草酚的酶为P450酶，需要黄酮3’位羟化酶(F3’H)及其辅酶(CPR)协同传递电子才能完成羟基化，操作较复杂。在改造微生物合成圣草酚时，多使用高效液相色谱法(HPLC)检测其含量，检测前需要使用0.22μm的滤头过滤，然后使用色谱纯的甲醇-水(45:55，V/V)溶液作为流动相，经过30min后才可以获得检测结果。因此，HPLC检测方法通量低、时间和人力成本高。在进行途径改造时，尤其是随机突变时，会产生数千到数亿甚至更多的突变子，仅仅依靠HPLC等手段是难以实现快速检测的。而且，在微生物发酵生产圣草酚时，中间产物中有柚皮素，或者直接使用柚皮素作为前体，这些前体的存在，也可能影响到相应产物的检测。因此，提供一种快速准确的高通量检测圣草酚的方法，对于快速检测圣草酚含量和筛选圣草酚高产菌株具有重要意义。
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术使用氢氧化钾或者氢氧化钠作为显色剂，可以和水溶液、无色的合成培养基或者发酵液中的圣草酚发生反应，在5min内出现明显的显色反应，根据颜色变化可以快速筛选圣草酚高产菌株。本专利技术的第一个目的是提供一种高通量检测圣草酚的方法，所述方法包括以下步骤：(1)向含圣草酚的待测液中添加显色剂氢氧化钾或者氢氧化钠进行显色反应，得到反应液；(2)用酶标仪检测反应液中圣草酚的浓度；所述显色反应和酶标仪检测均是在高通量孔板上进行的。在本专利技术的一种实施方式中，所述高通量孔板包含96深孔板、96浅孔板、48深孔板、24深孔板、12深孔板。在本专利技术的一种实施方式中，所述含圣草酚的待测液包括含圣草酚的水溶液、无色的合成培养基或菌株发酵液。在本专利技术的一种实施方式中，所述含圣草酚的无色的合成培养基包括但不限于SD，YNB，MOPS培养基。在本专利技术的一种实施方式中，显色剂浓度为0.1-10M。在本专利技术的一种实施方式中，检测体系中显色剂终浓度为0.05-9M。在本专利技术的一种实施方式中，检测反应液中圣草酚的浓度时，检测的波长范围为500-600nm。优选地，在水溶液中，使用NaOH处理圣草酚，处理后的反应液最佳检测波长为550-580nm。优选地，在无色的合成培养基中，使用KOH处理圣草酚，处理后的反应液最佳检测波长为560-570nm。本专利技术的第二个目的是提供一种高通量筛选圣草酚高产菌株的方法，是将改造后的待筛选菌株进行发酵后，静置沉淀菌体或者离心获得发酵上清液，添加显色剂氢氧化钾或者氢氧化钠进行显色反应，得到反应液；用酶标仪检测反应液中圣草酚的浓度；所述发酵、离心、显色、酶标仪检测均是在高通量孔板中进行的。在本专利技术的一种实施方式中，所述改造包括物理诱变、化学诱变或代谢工程改造。本专利技术发现了氢氧化钾和氢氧化钠可以作为显色剂，在5min内快速检测水溶液或者发酵液中圣草酚的浓度。圣草酚浓度越高，紫色越深，显色越快。并且在常见干扰物柚皮素存在时，依然具有较高的准确度，并可以使用酶标仪进行更为精确的检测。本专利技术使用的显色剂易于获得和制作，并且可以通过颜色变化的快慢和深浅来快速确定产物的浓度，也可以通过酶标仪进一步检测和确认。在微生物中进行改造或者突变时，可以批量处理发酵液，单次处理一块加入96个菌株发酵液的高通量96孔板只需30-60s，一个小时即可以处理5000-10000个单菌落，大大提高了筛选效率。附图说明图1：在YNB培养基中用4M的NaOH溶液处理不同浓度的圣草酚和柚皮素混合液。图2：在水溶液中用4M的NaOH溶液处理不同浓度的圣草酚和柚皮素混合液。图3：在YNB培养基中用4M的KOH溶液处理不同浓度的圣草酚和柚皮素混合液。图4：在水溶液中用4M的KOH溶液处理不同浓度的圣草酚和柚皮素混合液。图5：50mg/L的圣草酚、50mg/L的柚皮素、50mg/L的圣草酚与50mg/L的柚皮素的混合液在YNB培养基中用NaOH溶液处理后的全波长扫描图。图6：50mg/L的圣草酚、50mg/L的柚皮素、50mg/L的圣草酚与50mg/L的柚皮素的混合液在水溶液中用NaOH溶液处理后的全波长扫描图。图7：50mg/L的圣草酚、50mg/L的柚皮素、50mg/L的圣草酚与50mg/L的柚皮素的混合液在YNB培养基中用KOH处理后的全波长扫描图。图8：50mg/L的圣草酚、50mg/L的柚皮素、50mg/L的圣草酚与50mg/L的柚皮素的混合液在水溶液中用KOH处理后的全波长扫描图。图9：在YNB培养基中，使用4M的氢氧化钠溶液处理后，不同浓度柚皮素存在情况下，540nm下反应液的吸光值。图10：在水溶液中，使用4M的氢氧化钠溶液处理后，不同浓度柚皮素存在情况下550-580nm波长下反应液的吸光值，A：550nm；B：560nm；C：570nm；D：580nm。图11：在YNB培养基中，使用4M的氢氧化钾溶液处理后，不同浓度柚皮素存在情况下，550，560和570nm波长下反应液的吸光值，A：550nm；B：560nm；C：570nm。图12：在水溶液中，使用4M的氢氧化钾溶液处理后，不同浓度柚皮素存在情况下，560和570nm波长下反应液的吸光值，A：560nm；B：570nm。具体实施方式(一)培养基YNB培养基：1.72g/L的YNB培养基(Yeastnitrogenbase，酵母氮源培养基，无氨基酸和硫酸铵)，5g/L的硫酸铵，根据需要添加50mg/L的氨基酸；YPD培养基：20g/L葡萄糖，20g/L蛋白胨，10g/L酵母粉。(二)高效液相色谱检测圣草酚含量方法安捷伦1100，流动相：45％甲醇水溶液，添加0.3％的磷酸，混匀后有机膜过滤。流动相1mL/min，柱温30℃，检测波长290nm，体积10μL。样品运行时间30min。实施例11高通量显色反应配置柚皮素、圣草酚母液，溶解在100％乙醇溶液中，配置成4g/L的标准液。然后配置不同浓度的柚皮素和圣草酚混合液，分别使用水或者YNB培养基溶解稀释，并定容到100μL，然后分别添加100μL的4M的氢氧化钠溶液和4M的氢氧化钾溶液。常温反应5min后观察颜色反应。反应液颜色变化如图1-4所示，圣草酚浓度越高，紫色越深，显色越快。2反应液全波长扫描从被4M氢氧化钾和4M氢氧化钠处理过的反应液中，选取柚皮素终浓度为50mg/L，圣草酚终浓度为50mg/L，柚皮素-圣草酚终浓度各50mg/L的96孔板位置，放在酶标仪中做全波长扫描，扫描范围为230-998nm，步长为2nm。全波长扫描后，绘制扫描结果，超出吸光值检测上限值4的，一律标记为4。根据全波长扫描结果寻找干扰物对检测物质干扰最小的波长范围。可以发现，圣草酚经氢氧化钠处理后，在水溶液中，最佳检测波长为500-650nm之间；而在无色合成培养基中，最佳检测波长为500-550nm之间。圣草酚经氢氧化钾处理后，在水溶液中，最佳检测波长为500-650nm之间；在简单培养基中，最佳检测波长为500-600nm之间。全波长扫面结果见图5-8。3最佳检测波长区间的选择上述反应液的检本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种高通量检测圣草酚的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)向含圣草酚的待测液中添加显色剂氢氧化钾或者氢氧化钠进行显色反应，得到反应液；(2)用酶标仪检测反应液中圣草酚的浓度，所述显色反应和酶标仪检测均是在高通量孔板上进行的。

【技术特征摘要】
1.一种高通量检测圣草酚的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)向含圣草酚的待测液中添加显色剂氢氧化钾或者氢氧化钠进行显色反应，得到反应液；(2)用酶标仪检测反应液中圣草酚的浓度，所述显色反应和酶标仪检测均是在高通量孔板上进行的。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述高通量孔板包含96深孔板、96浅孔板、48深孔板、24深孔板、12深孔板。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述含圣草酚的待测液包括含圣草酚的水溶液、无色的合成培养基或菌株发酵液。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，显色剂浓度为0.1-10M。5.根据权利要求1或4所述的方法，其特征在于，检测体系中显色剂终浓度为0.05-9M。6.根据权利要求1或3所述的方法，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：周景文，陈坚，高松，徐晓宇，曾伟主，堵国成，吕云斌，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32