本发明专利技术提供参与柑橘果皮黄酮合成的氧甲基转移酶及其编码基因与应用，CitOMT1的表达量在瓯柑(Citrus reticulata cv.Suavissima)果实发育过程中与多甲氧基黄酮的积累呈正相关；体外酶活试验表明所述的氧甲基转移酶可在催化黄酮类化合物特定位点甲基化中应用，尤其可以催化槲皮素生成槲皮素3’,4’二甲酯；催化木犀草素生成金圣草素；催化圣草酚生成橙皮素、高圣草酚，催化黄芩素生成千层纸素A；催化7,8‑二羟基黄酮生成7‑羟基‑8‑甲氧基黄酮。该酶活反应条件简单，且不需要额外添加金属离子，具有较高的应用价值和研究前景。
Oxymethyltransferase and its coding genes involved in flavonoid synthesis in citrus peel and its application
The present invention provides an oxymethyltransferase involved in flavonoid synthesis in citrus peel and its coding gene and application. The expression level of CitOMT1 is positively correlated with the accumulation of polymethoxyflavones during the fruit development of Citrus reticulata cv. Suavissima. In vitro enzymatic activity test shows that the oxymethyltransferase can be used to catalyze methylation of specific sites of flavonoids, especially in the case of Citrus reticulata cv. Suavissima. Catalytic Quercetin to Quercetin 3', 4'-dimethyl ester; Luteolin to Jinshengcao; Catalytic Sage Phenol to Hesperetin and Gaoshengcao Phenol, Catalytic Baicalein to Thousand-Layer Paper A; Catalytic 7,8 Dihydroxyflavone to 7 hydroxy8 Methoxyflavone. The enzymatic reaction conditions are simple, and no additional metal ions are needed. It has high application value and research prospects.
【技术实现步骤摘要】
参与柑橘果皮黄酮合成的氧甲基转移酶及其编码基因与应用
本专利技术属于植物分子生物技术和基因工程
，具体涉及一种参与柑橘果皮黄酮合成的氧甲基转移酶CitOMT1及其编码基因与应用。
技术介绍
黄酮类化合物是植物中重要的次级代谢产物之一，在植物生长、发育及抗逆中发挥着重要的作用。已有文献表明氧甲基化的黄酮在抗氧化、抗肿瘤、降血糖以及预防心血管疾病等方面具有更强的活性，且其活性因甲氧基的位点和数量的变化有所不同。然而从植物中分离纯化或化学合成氧甲基化的黄酮工艺流程较为复杂。植物中存在氧甲基转移酶(O-methyltransferase,OMT)可以催化羟基化的黄酮类化合物在特定的位点甲基化，因此通过OMT酶法进行氧甲基化黄酮合成具有较高的应用前景。柑橘中存在多种OMT参与了柑橘果皮中多甲氧基黄酮(PMFs)的合成。有文献报道柑橘中存在一种OMT，可以催化黄酮的3位、5位、6位、7位羟基，且能通过大肠杆菌细胞反应系统催化槲皮素的3,3’,5,7位点甲基化，最终生成槲皮素3,3’,5,7四甲酯。但是从植物中分离鉴定得到能够同时催化黄酮3’位、4’位、6位、8位的氧甲基转移酶还未见报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供参与柑橘果皮黄酮合成的氧甲基转移酶，该氧甲基转移酶来源于芸香科柑橘属植物瓯柑，属于Ⅱ类氧甲基转移酶，但不依赖于金属离子。且体外酶活试验表明CitOMT1能够催化槲皮素终最生成槲皮素3’,4’甲酯；催化木犀草素生成金圣草素；催化圣草酚生成橙皮素、高圣草酚；催化黄芩素生成千层纸素A；催化7,8-二羟基黄酮生成7-羟基-8-甲氧基黄酮。其酶活反应条件简单，且不需要额外添加金属离子，易于操作。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：本专利技术提供的一个参与柑橘果皮黄酮合成的氧甲基转移酶CitOMT1，其氨基酸序列为以下之一：(1)SEQ:No.1所示的氨基酸序列；(2)或将SEQ:No.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失、添加且功能相同的蛋白质。本专利技术的第二个目的是提供所述氧甲基转移酶CitOMT1的编码基因，其核苷酸序列为以下之一：(1)SEQ:No.2所示的核苷酸序列；(2)或与SEQ:No.2所示的核苷酸序列具有90％及以上同源性且编码具有相同功能蛋白质的核苷酸序列。本专利技术提供用于扩增上述编码基因的引物对，其核苷酸序列分别为SEQ:No.3和SEQ:No.4所示。本专利技术提供上述编码基因的表达载体，所述表达载体为插入上述编码基因的表达载体pET32a。本专利技术提供含有上述表达载体的重组细胞或转化体，所述重组细胞为BL21(DE3)pLysS(Promega)。本专利技术的第三个目的是提供所述的氧甲基转移酶在体外表达实现催化黄酮类化合物在特定的位点甲基化中的应用，具体为提供所述氧甲基转移酶CitOMT1在催化槲皮素最终生成槲皮素3’,4’二甲酯；催化木犀草素生成金圣草素；催化圣草酚生成橙皮素、高圣草酚；催化黄芩素生成千层纸素A；催化7,8-二羟基黄酮生成7-羟基-8-甲氧基黄酮中的应用。本专利技术的有益效果：本专利技术首次从柑橘基因组数据库(www.citrusgenomedb.org)中分离出一个能够催化羟基化黄酮的3’位、4’位、6位、8位的氧甲基转移酶CitOMT1。通过构建pET32a表达载体并转化表达菌株bL21菌株得到目的蛋白。体外酶活试验表明CitOMT1能够催化槲皮素终最生成槲皮素3’,4’二甲酯；催化木犀草素生成金圣草素；催化圣草酚生成橙皮素、高圣草酚；催化黄芩素生成千层纸素A；催化7,8-二羟基黄酮生成7-羟基-8-甲氧基黄酮。该酶活反应条件简单，且不需要额外添加金属离子，具有较高的应用价值和研究前景。附图说明图1：瓯柑发育阶段三种主要PMFs变化(A,B,C)及CitOMT1在其发育阶段过程中表达模式(D)。图2：CitOMT1蛋白SDS-PAGE电泳图；其中：M：蛋白分子质量标准；U：诱导后上清样品；P：纯化的CitOMT1-pET重组蛋白。图3：HPLC对反应产物的鉴定；其中反应底物为槲皮素；QUE槲皮素、ISOR异鼠李素、TAM柽柳黄素、QUE-diMF槲皮素3’,4’二甲酯。图4：HPLC对反应产物的鉴定；其中反应底物分别为木犀草素(A)、圣草酚(B)、黄芩素(C)、7,8-二羟基黄酮(D)；LUC木犀草素、CHR金圣草素、ERI圣草酚、HOM高圣草酚、HES橙皮素、BAI黄芩素、ORO千层纸素A、7,8-DHF7,8-二羟基黄酮、7,8-MF7-羟基-8-甲氧基黄酮。图5：pH(A)和温度(B)对酶反应速率的影响。图6：CitOMT1的亚细胞定位图。具体实施方式下面结合附图和具体实施例对本专利技术作进一步的说明，但本实施例不限制本专利技术的保护范围。下述实施例中常规的基因操作方法参照《分子克隆实验指南》(第三版)实施例1：CitOMT1基因的克隆(一)实验方法基因克隆：将已报道的拟南芥OMT基因与柑橘基因组数据库(http://www.citrusgenomedb.org/)进行BLAST分析获得CitOMT1，核苷酸序列为SEQ:No.2。结合引物对SEQ:No.3和SEQ:No.4，以瓯柑果实油胞层cDNA为模板，参照FastStartHighFidelityPCRSystem(Roche)进行PCR扩增，其中PCR体系为：10×Buffer3μL，dNTP2.4μL，上下游引物(10μM)各1.2μL，酶0.3μL，DEPC处理的水21.3μL，cDNA0.6μL；PCR程序为：95℃预变性5min；95℃变性30sec，58℃退火30sec，72℃延伸1min，35个热循环；72延伸1min，4℃保存。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳后回收后连接到pGEM-TEasyvector(Promega)，进行测序分析。(二)实验结果经过测序验证，得到包含SEQ:No.2的CitOMT1-T载体。实施例2：CitOMT1在瓯柑发育阶段的表达模式分析(一)实验方法1.果实材料采集以不同发育阶段瓯柑果实为材料。分别于盛花后30(S1)、60(S2)、80(S3)、100(S4)、120(S5)、140(S6)、170(S7)、200(S8)天采摘，分为3个生物学重复，每个重复采摘8个果实；将瓯柑果皮分为油胞层和白皮层两个部位，切成小块后迅速放在液氮中，之后保存在-80℃。2.黄酮类化合物高效液相色谱(HPLC)分析分别称取瓯柑果皮油胞层和白皮层的样品粉末0.5g，用80％乙醇3mL超声30min，提取液离心(4000rpm，10min)，重复三次，合并上清(约9mL)，用于黄酮组分的测定。黄酮类化合物的检测采用Agilent1260VWD检测器，ODSC18柱(Sunfire5μm，4.6×250mm)，HPLC分析条件：以色谱乙腈(溶液A)和含有0.1％甲酸的超纯水(溶液B)为流动相，采用梯度洗脱，洗脱梯度为0～5min，溶液A20％；5～10min，溶液A20％～27％；10～15min，溶液A27％；15～25min，溶液A27％～40％；25～35min，溶液A40％～60％；35～40min，溶液A60％～80％；40～42min，溶液A80％～100％；42～本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一个参与柑橘果皮黄酮合成的氧甲基转移酶，其特征在于，所述氧甲基转移酶CitOMT1的氨基酸序列为以下之一：(1)SEQ:No.1所示的氨基酸序列；(2)或将SEQ:No.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失、添加且功能相同的蛋白质。
【技术特征摘要】
1.一个参与柑橘果皮黄酮合成的氧甲基转移酶，其特征在于，所述氧甲基转移酶CitOMT1的氨基酸序列为以下之一：(1)SEQ:No.1所示的氨基酸序列；(2)或将SEQ:No.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失、添加且功能相同的蛋白质。2.根据权利要求1所述的一个参与柑橘果皮黄酮合成的氧甲基转移酶，其特征在于，所述氧甲基转移酶CitOMT1编码基因的核苷酸序列为以下之一：(1)SEQ:No.2所示的核苷酸序列；(2)或与SEQ:No.2所示的核苷酸序列具有...
【专利技术属性】
技术研发人员：孙崇德，刘晓娟，赵晨拧，王岳，曹锦萍，李鲜，陈昆松，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33
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