一种用于提取柑橘果肉有色体中的质体小球的方法技术

本发明专利技术涉及一种用于提取柑橘果肉有色体中的质体小球的方法，其包括以下步骤：S1：从柑橘果肉中提取有色体；S2：超声破碎所述有色体，得到有色体裂解液；S3：使用含有碘海醇浓度梯度的系列溶液对所述有色体裂解液于150000g下梯度离心，分层后的上层液体即为质体小球。通过使用本发明专利技术的方法可有效地从柑橘果肉中提取有色体质体小球，分层效果明显，所得到的质体小球的纯度高，提纯效果好，并且保持了质体小球中的蛋白质在种类和结构上的完整性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及植物生化领域，更特别地，涉及一种用于提取柑橘果肉有色体中的质体小球的方法。
技术介绍
质体是植物中特有的细胞器，包括叶绿体、白色体和有色体。质体小球是广泛存在于质体中的脂蛋白颗粒(如图4的柑橘果肉电镜照片，黑色区域为质体小球)。在叶绿体中，质体小球在结构上与类囊体外膜相连，类囊体以起泡的形式产生质体小球。质体小球作为类囊体上的微域，在参与类囊体合成、修复、降解以及新陈代谢上具有重要作用。在柑橘果肉有色体(质体的一种形式)中也存在大量质体小球，然而它的功能并不清楚。质体小球的主要由单层膜、由该膜包裹的脂类物质和镶嵌在该膜上的约30种蛋白质组成，其中脂类物质包括质体醌、叶绿素醌、生育酚、三酰甘油、类胡萝卜素等。镶嵌于膜上的蛋白质可分成三大类：(1)丰度最高的原纤维蛋白(FBNs)；(2)参与脂类代谢物的酶，例如，ABC1K激酶以及部分参与类胡萝卜素和维生素E代谢的酶类；(3)其他蛋白质。质体小球的膜上镶嵌的蛋白质与其功能有关，改变质体小球上蛋白质会引起代谢物的变化。拟南芥中关于叶绿体质体小球的蛋白组成及部分结构基因的功能已得到了初步验证，但是对于非绿色组织中的质体小球的起源、发育、蛋白质组成及调控机制并不清楚。为了研究质体小球在柑橘果肉等非绿色组织中的功能，首先需要分离得到质体小球。中国专利201010260376.8公开了一种提纯柑橘果肉有色体的方法，然而尚没有专门针对柑橘果肉有色体的质体小球的提取方法。超速密度梯度离心是最常用的质体小球提纯方法。理想的梯液要具备优良的化学稳定性、高溶合度、低渗透性、好的溶剂中稳定性以及较低的光吸收性等特性这种材料最好还是廉价的。例如，蔗糖就是一种比较合适的梯度材料。尽管它在高密度(>30％W/N)时粘性系数较大，但综合比较表明它可以广泛应用。但由于蔗糖在各种密度下都具有有较高的渗透性(即使是低密度时也如此)，因此，分离一些渗透性敏感的生物组分时，需要选择其他梯度材料，如由pharmacia公司开发的Ficoll等等。对细胞、亚细胞结构或其他生物大分子的等密度离心分离也各有不同要求。常用于等密度离心梯度材料见表1所示：表1等密度离心梯度的应用材料名称DNARNA核蛋白膜亚细胞器细胞病毒蔗糖不适合不适合可用较好较好可用较好聚葡糖不适合不适合不适合可用可用最佳较好氯化铯最佳较好最佳不适合不适合不适合较好细胞分离液不适合不适合不适合可用较好较好可用海碘醇可用可用最佳最佳最佳较好较好从表1可以看出，不同的生物样品对梯度材料的要求差异较大。Ytterberg等2006年在拟南芥中利用细胞分离液(Percoll)进行超速离心，分离得到质体小球，并通过质谱鉴定了其中的33种蛋白质。2012年PeterK.Lundquist等在此基础上进一步优化方案并使用新技术移除了部分可信度不高的蛋白，同时重新鉴定了三种蛋白质可能定位在质体小球上，从而将质体小球上的蛋白质确定为30种。从辣椒有色体中分离得到的质体小球上有27种蛋白质被鉴定，其中有12个与拟南芥质体小球蛋白一致(Ytterberg等2006)。以上实验说明该方法对分离质体小球效果比较明显。然而，非绿色组织的柑橘果肉质体小球在来源和功能上与拟南芥和辣椒存在明显的特异性。在尝试上述方法后，质体小球并不能分层，或者分层效果不明显，因此，上述方法不适于柑橘果肉质体小球的提纯分离。
技术实现思路
为解决以上技术问题，本专利技术提供了一种用于提取柑橘果肉有色体中的质体小球的方法，其包括以下步骤：S1：从柑橘果肉中提取有色体；S2：超声破碎所述有色体，得到有色体裂解液；S3：使用含有碘海醇浓度梯度的系列溶液对所述有色体裂解液于150000g下梯度离心，分层后的上层液体即为质体小球。进一步地，所述含有碘海醇浓度梯度的系列溶液依次由碘海醇质量体积比分别为20％、10％、7.5％和5％的碘海醇溶液组成。优选地，在超声破碎前还包括步骤：向S1得到所述有色体中添加蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂。优选地，在超声破碎前还包括步骤：将所述有色体速冻，维持凝固状态一段时间后，于冰上融化。优选地，S3中梯度离心所用的离心管内壁预先用无菌的牛血清涂匀。优选地，所述方法包括以下步骤：S1:从1600克柑橘果肉中提取有色体，并将所述有色体于6000g下离心7min得到沉淀；S2：超声破碎所述有色体，得到有色体裂解液，包括以下步骤：S2.1：用4ml缓冲液B重悬所述沉淀，并向其中添加100μl蛋白酶抑制剂和100μl磷酸酶抑制剂，得到有色体混合液；S2.2：将所述有色体混合液用液氮速冻，并于-80℃下放置1.5h，然后在冰上融化；S2.3：冻融处理的所述有色体混合液在冰浴状态下，用超声破碎仪破碎，得到有色体裂解液；S3：使用含有碘海醇的溶液对所述有色体裂解液于150000g下梯度离心，包括以下步骤：S3.1：取13.2ml离心管，用无菌的牛血清均匀涂抹于所述离心管内壁上；S3.2：用缓冲液A稀释缓冲液B，得到碘海醇含量分别为质量体积比20％、10％、7.5％和5％的碘海醇溶液，向所述离心管中依次加入4ml所述有色体裂解液加入所述离心管、2ml20％的碘海醇溶液、1ml10％的碘海醇溶液、2ml7.5％的碘海醇溶液和3ml5％的碘海醇溶液；S3.3：将加有所述有色体裂解液和碘海醇密度梯度溶液的离心管于4℃150000g下离心15h，液体分层后，最上层液体即为质体小球。其中，所述缓冲液A的配方如下：所述缓冲液B的配方如下：通过使用本专利技术的方法可有效地从柑橘果肉中提取有色体质体小球，分层效果明显，所得到的质体小球的纯度高，提纯效果好，并且保持了质体小球中的蛋白质在种类和结构上的完整性。附图说明图1为本专利技术的方法的流程图；图2为光镜下的有色体照片；图3为使用本专利技术的方法提取的质体小球的蛋白免疫印迹照片；图4为柑橘果肉的电子显微镜照片。具体实施方式以下结合实例和附图对本专利技术的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本专利技术，并非用于限定本专利技术的范围。如图1所示，通过以下步骤来提取质体小球：S1:从1600克柑橘果肉中提取有色体(有色体在光镜下的形态如图2所示)，并将所述有色体于6000g下离心7min得到沉淀；S2.1：用4ml缓冲液B重悬所述沉淀，并向其中添加100μl蛋白酶抑制剂(罗氏，REF.05892791001)和100μl磷酸酶抑制剂(罗氏，REF.04906837001)，得到有色体混合液；S2.2：将所述有色体混合液用液氮速冻，并于-80℃下放置1.5h，然后在冰上融化；S2.3：冻融处理的所述有色体混合液在冰浴状态下，用超声破碎仪破碎，30％功率，每次5秒，超声6次，共30秒，得到有色体裂解液；S3.1：取13.2ml离心管，用无菌的牛血清均匀涂抹于所述离心管内壁上；S3.2：用缓冲液A稀释缓冲液B，得到碘海醇含量分别为质量体积比20％、10％、7.5％和5％的碘海醇溶液，向所述离心管中依次加入4ml所述有色体裂解液加入所述离心管、2ml20％的碘海醇溶液、1ml10％的碘海醇溶液、2ml7.5％的碘海醇溶液和3ml5％的碘海醇溶液；S3.3：配平之后，使用转头BECKMANSW41Ti，将加有所述有色体裂解液和碘海醇密度梯度溶液的离心管于4℃150本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于提取柑橘果肉有色体中的质体小球的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1：从柑橘果肉中提取有色体；S2：超声破碎所述有色体，得到有色体裂解液；S3：使用含有碘海醇浓度梯度的系列溶液对所述有色体裂解液于150000g下梯度离心，分层后的上层液体即为质体小球。

【技术特征摘要】
1.一种用于提取柑橘果肉有色体中的质体小球的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1：从柑橘果肉中提取有色体；S2：超声破碎所述有色体，得到有色体裂解液；S3：使用含有碘海醇浓度梯度的系列溶液对所述有色体裂解液于150000g下梯度离心，分层后的上层液体即为质体小球。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述含有碘海醇浓度梯度的系列溶液依次由碘海醇质量体积比分别为20％、10％、7.5％和5％的碘海醇溶液组成。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在超声破碎前还包括向S1得到所述有色体中添加蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在超声破碎前还包括步骤：将所述有色体速冻，维持凝固状态一段时间后，于冰上融化。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，S3中梯度离心所用的离心管的内壁预先用无菌的牛血清涂匀。6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1:从1600克柑橘果肉中提取有色体，并将所述有色体于6000g下离心7min得到沉淀；S2：超声破碎所述有色体，得...

【专利技术属性】
技术研发人员：邓秀新，刘云，曾云流，谢宗周，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42