一种植物单染色体的显微分离方法技术

本发明专利技术提供一种植物单染色体的显微分离方法，先将需要进行单染色体分离的植物器官置于一氧化二氮气体中进行预处理，随后对预处理后的植物器官进行固定处理和酶解处理，将酶解后的植物器官破碎并配制成细胞悬液，将细胞悬液滴加到载玻片或盖玻片上得到染色体装片，向制得的染色体装片中滴加染料后放入倒置显微镜的视场光路中，在显微操作手的操作手臂上安装毛细管针，在倒置显微镜的观察下通过显微操作手调节毛细管针至目标染色体边缘，操控毛细管针将目标染色体分离。本发明专利技术方法操作简单、分离效率高、能有效分离植物单染色体，且避免染色体污染问题。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于单染色体分离
，具体涉及一种植物单染色体的显微分离方法。
技术介绍
染色体的微分离是随着分子生物学发展、结合了分子生物学和细胞遗传学技术而诞生的一种特异性基因克隆技术，能根据实验需要分离任何染色体或片段，然后创建有关DNA文库，并完成相关的分子生物学研究。染色体显微切割是指在显微镜下将染色体区段或目标染色体从标本中切割和分离出来的技术，是细胞遗传学和分子遗传学结合的桥梁。自创立以来，显微克隆与显微分离技术在人类和动物的病理研究、基因定位、文库构建、基因克隆等领域得到了广泛应用，并取得了显著的成效。不同植物的染色体分离时需要利用不同的方法，现有的微细玻璃针分离法主要应用于动物体细胞染色体分离领域，该方法存在对制片技术要求较高、操作技术难度大、染色体容易污染、效率不高等缺点，且不适用于植物单染色体的分离。
技术实现思路
针对现有技术存在的上述不足，本专利技术要解决的技术问题是：针对现有单染色体分离技术操作难度大、染色体容易污染、效率不高的不足之处，而提供一种操作简单、分离效率高、分离效果好、染色体不被污染的植物单染色体的显微分离方法。为了解决上述技术问题，本专利技术采用如下技术方案：一种植物单染色体的显微分离方法，先将需要进行单染色体分离的植物器官置于一氧化二氮气体中进行预处理，随后对预处理后的植物器官进行固定处理和酶解处理，将酶解后的植物器官破碎并配制成细胞悬液，将细胞悬液滴加到载玻片或盖玻片上得到染色体装片，向制得的染色体装片中滴加染料后放入倒置显微镜的视场光路中，在显微操作手的操作手臂上安装毛细管针，在倒置显微镜的观察下通过显微操作手调节毛细管针至目标染色体边缘，操控毛细管针将目标染色体分离。本专利技术针对采用现有的单染色体分离方法容易出现分离难度大、染色体容易污染的技术问题，通过创造性的研究提出前期制片时采用一氧化二氮对植物器官进行预处理，采用这样的预处理方法处理后的植物细胞经酶解后染色体更容易分散开，且采用滴片的方式进行制片，仅利用滴加时的重力就可以使植物细胞破裂，植物染色体中单个染色体之间分散效果更好，且这种滴片方式不会对染色体造成伤害，能够得到完整的、均匀分布、分散度较好的染色体，使后期分离的难度降低，避免了分离过程中染色体之间距离太近而引起的目标染色体被其他染色体污染问题，且染色体更加分散也使得分离效率提高。本专利技术借助显微操作手对植物单染色体进行分离，将装片置于显微镜下可以使操作者能够在可见的状态下选择目标染色体，并在分离过程中可以对分离的状态进行实时监控，采用显微操作手控制毛细管针进行染色体分离，不会对染色体带来负面影响，得到的单染色体形态和性状均保持原有状态。进一步，在显微操作手的操作手臂上安装毛细管针时，使毛细管针与水平面的安装角度为30°。采用这样的安装角度，毛细管针尖与盖玻片接触的紧密度合适，轻微移动时不会影响到其他染色体和细胞的移动，进而便于进行染色体分离，且这样的安装角度在分离时不容易将毛细管针的针尖折断，便于单独吸附染色体或剥离开其他染色体；既避免了安装角度过小时针尖与装片表面的接触较多，容易把装片戳动，不利于毛细管针的移动，有可能会把整个细胞移动，影响分离效果的问题，也避免了安装角度过大时，针尖与装片之间接触太过陡立，针尖接触染色体装片时容易折断等的问题。进一步，所述毛细管针的针孔直径为1~5μm。本专利技术针对植物染色体的大小，选用这种针孔直径的毛细管针，不论是从针尖还是从针孔空隙来说都更适用于植物染色体的分离，且既避免了针孔直径过小使得针尖过细进而在挑取或剥离时容易被折断的问题，也避免了针孔直径过大而在显微镜视野中目标过大，容易触碰到其他常染色体，进而不利于染色体分离，容易使目标染色体受到其他染色体污染的问题。作为优化，待染色体装片上的染料挥发至恰好粘附在所述染色体装片上时，再通过显微操作手操控毛细管针对目标染色体进行分离；恰好粘附在所述染色体装片上是指将染料挥发至将近干燥，晃动染色体装片染料恰好不在染色体装片上流动，且染料也没有在染色体装片上完全干燥成膜时。这样，可以避免染液过多时剥离出的染色体漂浮在染液中，如果空气流动，染色体会随之飘走，难以捕捉分离的单个染色体，也避免了染液完全干燥后，细胞内容物质和染液混在一起形成一层薄膜，同一个细胞中的染色体粘连在一起，不利于单条染色体分离的问题。作为又一优化，当目标染色体周围有其他染色体和杂质存在时，先在倒置显微镜的观察下通过显微操作手操控毛细管针将目标染色体周围的染色体和杂质剥离，再在显微操作手上安装新毛细管针，在倒置显微镜的观察下通过显微操作手调节新毛细管针至目标染色体边缘，操控新毛细管针将目标染色体分离。这样的操作方法可以避免目标染色体被其他染色体或者杂质所污染，且将其他杂质和染色体分离后，目标染色体的分离难度也大幅降低，分离效率提高。作为再一优化，当目标染色体周围有其他染色体和杂质存在时，先在倒置显微镜的观察下通过显微操作手操控毛细管针将目标染色体周围的染色体和杂质剥离，再在显微操作手上安装新的毛细管针，在毛细管针的一端连接注射器，并向所述染色体装片上添加水或染色，操控注射器利用注射器的吸力将目标染色体吸附入毛细管针中，达到分离目的。采用注射器的吸力强，将目标染色体吸附到毛细管针内，不容易使分离得到的单条染色体从毛细管上脱落，避免了粘取染色体时染色体分离后又脱落的问题。作为另一优化，将分离得到的目标染色体粘附在毛细管针上，将粘附有目标染色体的毛细管针折断于TE缓冲液中，并进行离心处理后取上清液，得到植物单染色体。分离后的染色体再粘附在毛细管针上，可以降低分离的玉米单染色体受其他杂质污染的风险，采用TE缓冲液度对分离得到的单染色体进行溶解和重悬，使单染色体分离效果更好。作为再一优化，先将需要进行单染色体分离的植物器官置于压力为0.5~1个大气压的一氧化二氮气体中进行预处理2~3h，再采用体积浓度为90%的醋酸溶液对预处理后的植物器官进行固定处理2～3h，随后采用纤维素酶和果胶酶对固定处理后的植物器官进行酶解处理5~6h，将酶解后的植物器官破碎并配制成细胞悬液，将细胞悬液滴加到载玻片或盖玻片上得到染色体装片。采用这样的方法制得的染色体装片中染色体整体呈圆形或椭圆形、分散度好，减少了对染色体的伤害，得到了比较完整的染色体，便于进行后续的单染色体分离。进一步，所述植物器官为玉米器官。本专利技术方法尤其适用于玉米器官中单染色体的分离，分离效果好、分离效率高，10~30分钟即可分离出1条染色体。相比现有技术，本专利技术具有如下有益效果：1、本专利技术采用一氧化二氮预处理加滴片制备染色体装片，获得的分裂相染色体呈圆形或椭圆形分散，分布均匀，染色体交叉少，分散度较好，并且该制备方法可以通过调整材料的浓度和滴片的高度控制染色体分散的程度，解决了显微分离植物单染色体样本制备难的问题。2、采用本专利技术方法分离单染色体，借助于显微操作手，10～30分钟就可以分离出1条染色体，比现有的分离方法而言降低了操作的难度，提高了单染色体分离的效率。3、本专利技术对分离时间、毛细管针大小、下针角度及挑取方式进行了创造性研究，采用本专利技术方法分离单染色体，染色体被污染的概率降低，使分离得到的单染色体更加纯净，为今后开展植物分子遗传图谱和物理图谱构建、重要基因分离本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种植物单染色体的显微分离方法，其特征在于，先将需要进行单染色体分离的植物器官置于一氧化二氮气体中进行预处理，随后对预处理后的植物器官进行固定处理和酶解处理，将酶解后的植物器官破碎并配制成细胞悬液，将细胞悬液滴加到载玻片或盖玻片上得到染色体装片，向制得的染色体装片中滴加染料后放入倒置显微镜的视场光路中，在显微操作手的操作手臂上安装毛细管针，在倒置显微镜的观察下通过显微操作手调节毛细管针至目标染色体边缘，操控毛细管针将目标染色体分离。

【技术特征摘要】
1.一种植物单染色体的显微分离方法，其特征在于，先将需要进行单染色体分离的植物器官置于一氧化二氮气体中进行预处理，随后对预处理后的植物器官进行固定处理和酶解处理，将酶解后的植物器官破碎并配制成细胞悬液，将细胞悬液滴加到载玻片或盖玻片上得到染色体装片，向制得的染色体装片中滴加染料后放入倒置显微镜的视场光路中，在显微操作手的操作手臂上安装毛细管针，在倒置显微镜的观察下通过显微操作手调节毛细管针至目标染色体边缘，操控毛细管针将目标染色体分离。2.根据权利要求1所述植物单染色体的显微分离方法，其特征在于，在显微操作手的操作手臂上安装毛细管针时，使毛细管针与水平面的安装角度为30°。3.根据权利要求1所述植物单染色体的显微分离方法，其特征在于，所述毛细管针的针孔直径为1~5μm。4.根据权利要求1所述植物单染色体的显微分离方法，其特征在于，待染色体装片上的染料挥发至恰好粘附在所述染色体装片上时，再通过显微操作手操控毛细管针对目标染色体进行分离。5.根据权利要求1所述植物单染色体的显微分离方法，其特征在于，当目标染色体周围有其他染色体和杂质存在时，先在倒置显微镜的观察下通过显微操作手操控毛细管针将目标染色体周围的染色体和杂质剥离，再在显微操作手上安装新毛细管针，在倒置显微镜的观察下通过显微操作手调...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈发波，姚启伦，何莲，胡云，李玉洁，邓丽，
申请(专利权)人：长江师范学院，
类型：发明
国别省市：重庆;50