一种L-谷氨酸氧化酶纯化方法技术

本发明专利技术公开了一种L‑谷氨酸氧化酶纯化方法。包括：通过一步克隆的方法在载体质粒的多克隆位点插入蛋白标签ChiBD‑AB；在蛋白标签后融合目的蛋白LGOX基因；将连接蛋白标签ChiBD‑AB和目的蛋白LGOX基因的质粒导入宿主菌株表达，获取粗酶液；在粗酶液中加入几丁质作为吸附剂，之后洗脱，获取纯化酶液。本发明专利技术所使用的蛋白纯化标签ChiBD‑AB对几丁质具有特异性吸附能力，可从源头上杜绝杂蛋白的混入；使用试剂成本低，蛋白纯化方法操作简便，可适应大规模应用。

Purification of L-glutamate oxidase

The invention discloses a purification method of L glutamate oxidase. Including: inserting protein label ChiBD AB into the polyclonal site of vector plasmid by one-step cloning method; fusing the target protein LGOX gene after protein labeling; introducing the plasmid of ligand label ChiBD AB and target protein LGOX gene into host strain expression to obtain crude enzyme solution; adding chitin into crude enzyme solution as adsorbent, then eluting and obtaining purified enzyme solution. The protein purification label ChiBD AB used in the invention has specific adsorption capacity for chitin, and can eliminate the mixing of impure proteins from the source; the reagent cost is low, the protein purification method is simple to operate, and can be adapted to large-scale application.

【技术实现步骤摘要】
一种L-谷氨酸氧化酶纯化方法
本专利技术属于生物工程
，具体涉及一种L-谷氨酸氧化酶纯化方法。
技术介绍
蛋白质的分离纯化在生物化学研究应用中使用广泛，是一项重要的操作技术，是蛋白质后续性能表征的基础。蛋白纯化要利用不同蛋白间内在的相似性与差异，利用各种蛋白间的相似性来除去非蛋白物质的污染，而利用各蛋白质的差异将目的蛋白从其他蛋白中纯化出来。每种蛋白间的大小、形状、电荷、疏水性、溶解度和生物学活性都会有差异，利用这些差异可将蛋白从混合物如大肠杆菌裂解物中提取出来得到重组蛋白。目前常见的蛋白纯化方法有：(1)根据分子大小不同的分离方法，透析和超过滤(利用蛋白质分子不能通过半透膜的性质)；密度梯度离心(蛋白质在介质中离心时质量和密度较大的颗粒沉降较快)；凝胶过滤(一种柱层析)；(2)利用溶解度差别分离，等电点沉淀法(由于蛋白质分子在等电点时净电荷为零，减少了分子间静电斥力，因而容易聚集沉淀，此时溶解度最小)；盐溶与盐析(利用一定浓度盐溶液增大或减小蛋白质的溶解度)；(3)根据电荷不同的分离方法，主要包括电泳和离子交换层析分离；(4)蛋白质的选择吸附分离(利用颗粒吸附力的强弱不同达到分离目的)；(5)根据配体特性的分离——亲和层析(利用蛋白质分子与另一种称为配体的分子能够特异而非共价地结合这一生物性质)；(6)低温有机溶剂沉淀法，用与水可混溶的有机溶剂，甲醇，乙醇或丙酮，可使多数蛋白质溶解度降低并析出。其中，蛋白质亲和层析技术适应于理化性质差异性较小而难分离的蛋白质，亲和层析利用固相介质中的配基与混合生物分子之间亲和能力不同而进行分离，当蛋白混合液通过层析柱时，与配基能够特异性结合的蛋白质就会被吸附固定在层析柱中，其他的蛋白质对配体不具有特异性的结合能力，将通过柱子洗脱下来，这种结合在一定条件下是可逆的，选用适当的洗脱液，改变缓冲液的离子强度和pH值或者选择更强的配体结合溶液将结合的蛋白质洗脱下来，而无亲和力的蛋白质最先流出层析柱。它通常只需要一步操作便能将目的蛋白从混合物中分离出来，并且纯度很高。目前最常见的蛋白质亲和层析方法为使用负载有镍离子的吸附胶吸附带有His-tag的目的蛋白后使用以咪唑为有效成分的洗脱液洗脱并收集目的蛋白。L-谷氨酸氧化酶(LGOX)是一种可以氧化L-谷氨酸生成H2O2、氨和α-酮戊二酸的蛋白酶类，该酶常用于L-谷氨酸定量检测、临床生化检验中的谷丙转氨酶、谷草转氨酶和γ-谷氨酰基转移酶活性测定等，该酶自20世纪80年代被发现以来，一直是工具酶研究的热点之一。但L-谷氨酸氧化酶制剂的纯化存着成本高，操作繁琐等问题。如卢婵等人公开了“L-谷氨酸氧化酶的克隆表达，纯化及酶学性质研究”，使用His-tag作为纯化标签，最终可获得比酶活为2.1U/mg，蛋白纯化倍数为1.9倍的谷氨酸氧化酶。His-tag是目前应用最广泛的蛋白纯化标签，对某些金属离子有很好的亲和性且能被以咪唑为有效成分的洗脱液洗脱，纯化效率好。但该方法所使用的亲和层析柱填料价格昂贵，导致纯化蛋白成本较高，故一般只适合实验室内小批量制备蛋白制剂。张利坤等人公开了“环氧树脂固定化L-谷氨酸氧化酶”，使用(NH4)2SO4分级沉淀法纯化谷氨酸氧化酶，当(NH4)2SO4溶液饱和度为45％时，可沉淀大部分蛋白。该方法成本较低，可适应大规模应用，但操作较为繁琐，全过程需要近24小时。另一方面，盐析法过程中会有大量杂蛋白混入，导致酶制剂不纯。李玲等人公开了“L-谷氨酸氧化酶的分离纯化及酶学性质的研究”，采用硫酸铵分级沉淀、HPLC脱盐、离子交换、SuperdexG-200凝胶层析等步骤从华美链霉菌(Streptomycessp.)发酵液中分离纯化L-谷氨酸氧化酶。该方法需要四道工序，耗时多。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种低成本，便捷的L-谷氨酸氧化酶纯化方法。为实现上述技术目的，本专利技术采用如下技术方案：一种L-谷氨酸氧化酶纯化方法，包括：通过一步克隆的方法在载体质粒的多克隆位点插入蛋白标签ChiBD-AB；在蛋白标签后融合目的蛋白基因LGOX；将连接蛋白标签ChiBD-AB和目的蛋白基因LGOX的质粒导入宿主菌株表达，获取粗酶液；在粗酶液中加入几丁质作为吸附剂，之后洗脱，获取纯化酶液；其中，所述蛋白标签ChiBD-AB的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。进一步的，所述带有ChiBD-AB标签的质粒构建方法如下：通过PCR技术扩增出来源于ChitinolyticbactermeiyuanensisSYBC-H1基因组的ChiBD-AB的基因片段；将上述基因片段ChiBD-AB通过一步克隆法与线性化的pET系列质粒连接，得带有ChiBD-AB标签的质粒；将带有ChiBD-AB标签的质粒转化入大肠杆菌感受态细胞中，涂布于固体培养基培养过夜，通过Kan抗性、菌落PCR与酶切验证筛选出阳性转化子；挑取验证正确的转化子，接入液体培养基中培养后提取质粒并测序，验证正确的质粒命名为pETAB，储存备用。其中，所述所述载体质粒选用pET-29a；选择NdeI与XhoI位点进行酶切线性化。进一步的，在蛋白标签后融合目的蛋白基因的方式如下：通过PCR技术扩增出带有同源臂的目的L-谷氨酸氧化酶基因片段；选择酶切位点，将pETAB质粒酶切为线性化；将目的蛋白LGOX基因片段与pETAB线性化质粒通过一步克隆技术连接，导入大肠杆菌感受态细胞中，涂布于固体培养基进行培养，通过Kan抗性与菌落PCR筛选出阳性转化子；挑取转化子接入含有卡那霉素的液体培养基中培养后提取质粒并测序，获取验证正确的质粒pETAB-LGOX。进一步的，目的蛋白基因表达方法为：将连接蛋白标签ChiBD-AB和目的蛋白基因LGOX的质粒导入宿主菌株；培养过程中加入IPTG诱导表达目的蛋白。进一步的，目的蛋白纯化方法为：在含有目的蛋白的粗酶液中加入几丁质吸附剂孵育；离心后去除上清液，使用磷酸盐缓冲液冲洗吸附剂以去除残留杂蛋白；洗脱吸附剂，收集洗脱液；使用超滤法浓缩目的蛋白，获取纯化酶液。其中，所述几丁质吸附剂经超声处理，添加量为30g/L；进一步的，孵育条件为20℃，30分钟。进一步的，采用NaCl溶液，通过梯度洗脱的方式洗脱吸附剂。；本专利技术的方法具有如下有益效果：(1)本专利技术所使用的蛋白纯化标签ChiBD-AB对几丁质具有特异性吸附能力，这是一般杂蛋白所不具有的，故可从源头上杜绝杂蛋白的混入；(2)本专利技术使用的吸附剂几丁质是一种广泛存在于自然界的物质(虾、蟹、昆虫等动物的外壳，真菌细胞壁)，制备成本低，且使用NaCl洗脱吸附剂，更廉价，因此本专利技术的蛋白纯化方法可适应大规模应用。(3)本专利技术的蛋白纯化方法操作简便，在吸附后只需直接用NaCl溶液洗脱，更加便捷，一般只需1-2小时的操作即可完成一次蛋白纯化。附图说明图1是pETAB-LGOX质粒结构示意图；图2是ChiBD-AB目的片段PCR结果电泳；图3是pETAB双酶切验证电泳；图4是LGOX目的片段PCR结果电泳；图5是pETAB-LGOX酶切验证电泳；图6是蛋白洗脱流程；图7是纯化过程SDS-PAGE凝胶电泳；1为AB-LGOX重组蛋白粗酶液；2为经几丁质吸附后离心上清；3为经几丁质吸附后离心沉淀；4-6为0.5，1.本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种L‑谷氨酸氧化酶纯化方法，其特征在于，包括：通过一步克隆的方法在载体质粒的多克隆位点插入蛋白标签ChiBD‑AB；在蛋白标签后融合目的蛋白LGOX基因；将连接蛋白标签ChiBD‑AB和目的蛋白LGOX基因的质粒导入宿主菌株表达，获取粗酶液；在粗酶液中加入几丁质作为吸附剂，之后洗脱，获取纯化酶液；其中，所述蛋白标签ChiBD‑AB的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

【技术特征摘要】
1.一种L-谷氨酸氧化酶纯化方法，其特征在于，包括：通过一步克隆的方法在载体质粒的多克隆位点插入蛋白标签ChiBD-AB；在蛋白标签后融合目的蛋白LGOX基因；将连接蛋白标签ChiBD-AB和目的蛋白LGOX基因的质粒导入宿主菌株表达，获取粗酶液；在粗酶液中加入几丁质作为吸附剂，之后洗脱，获取纯化酶液；其中，所述蛋白标签ChiBD-AB的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。2.根据权利要求1所述的一种L-谷氨酸氧化酶纯化方法，其特征在于，带有蛋白标签ChiBD-AB的质粒构建方法如下：通过PCR方法扩增蛋白标签ChiBD-AB的基因序列；将扩增的ChiBD-AB基因片段通过一步克隆的方法与线性化的pET系列质粒连接，获取连接蛋白标签的质粒；将连接蛋白标签的质粒导入大肠杆菌感受态细胞中，涂布于固体培养基进行培养，通过Kan抗性与菌落PCR筛选出阳性转化子；挑取验证正确的转化子，接入液体培养基中培养后提取质粒并测序，获取验证正确的质粒pETAB。3.根据权利要求2所述的一种L-谷氨酸氧化酶纯化方法，其特征在于，所述载体质粒选用pET-29a。4.根据权利要求3所述的一种L-谷氨酸氧化酶纯化方法，其特征在于，选择NdeI与XhoI位点进行酶切线性化。5.根据权利要求2所述的一种L-谷氨酸氧化酶纯化方法，其特征在于，在蛋白标签后融合目的蛋白基因的...

【专利技术属性】
技术研发人员：董维亮，陈建豪，周杰，徐宁，姜岷，
申请(专利权)人：南京工业大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32