假单胞菌zjut126及在生产L-草铵膦中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一株假单胞菌Pseudomonas sp.zjut126及其在生产L‑草铵膦中的应用，能选择性水解外消旋N‑癸酰‑(D,L)‑草铵膦生成L‑草铵膦，选择性接近100％。此外，本发明专利技术采用萃取法分离反应生成的混合物，萃余液经浓缩、冷冻干燥，得到L‑草铵膦产品。L‑草铵膦萃取分离的收率94.6％，产品中L‑草铵膦含量92％，ee值>95.2％。本发明专利技术方法成本低，效率高，易于规模化。

Pseudomonas sp. zjut 126 and its application in the production of L-glyphosate

The invention discloses Pseudomonas sp.zjut126 and its application in the production of L glyphosate. It can selectively hydrolyze racemic N Decanoyl (D, L) glyphosate to produce L glyphosate with a selectivity of nearly 100%. In addition, the mixture formed by the reaction is separated by extraction method, and the extract residue is concentrated and freeze-dried to obtain L glyphosate product. The extraction and separation yield of L-glyphosate was 94.6%. The content of L-glyphosate in the product was 92%. The EE value was more than 95.2%. The method of the invention has low cost, high efficiency and is easy to scale.

【技术实现步骤摘要】
假单胞菌zjut126及在生产L-草铵膦中的应用
本专利技术涉及一株假单胞菌(Pseudomonassp.)zjut126及在生物催化领域的应用，该菌株具有高手性选择性拆分外消旋N-癸酰-(D,L)-草铵膦生产L-草铵膦的能力。用简单的萃取法，就可以从反应混合物中分离得到高纯度的L-草铵膦。
技术介绍
随着环保观念的加强和可持续发展战略的实施，高效、低毒、高活性、低残留已成为农药发展的必然趋势。一些手性化合物的不同对映体往往表现出不同活性。比如一种对映体活性是高效，另一种对映体却是低效甚至起相反的作用。草铵膦是一种高效、低毒、非选择性(灭杀性)触杀型除草剂，也是一种手性农药，只有L型草铵膦具备植物毒性。市售的草铵膦多为外消旋体。若能以单一的L-构型的形式投入使用，不仅可以提高产品药效，而且其使用量可以降低一倍。随着国家农药减量增效政策的实施，绿色生物农药成为研究热点，高光学纯度的L-草铵膦具有广阔的市场前景。单一对映异构体可以由化学、生物法等合成。生物催化法优于化学法的优点是：酶(或细胞)催化反应通常有高的立体选择性和区域选择性，而且在温和的条件下进行，可以避免使用严酷的条件，从而避免副反应的发生。此外，生物催化法可以减少对环境污染，节省成本，符合当今绿色化学发展趋势。目前工业上合成L-草铵膦的方法是化学法，例如日本的明治制果公司和中国永农生物科技有限公司合作开发的酮酸不对称加氢合成L-草铵膦的技术。但是化学方法能耗高而且污染严重。鉴于生物催化反应条件比较温和、立体选择性高、污染少等特点，未来生物法生产L-草铵膦将更有前景。本专利技术就是筛选生物法生产L-草铵膦的微生物细胞催化剂，将外消旋的N-癸酰-(D,L)-草铵膦立体选择性水解，生成L-草铵膦。美国专利US6,686,181B1(2004)报道了一种酶法生产L-草铵膦的方法。该酶是从能水解N-乙酰-(D,L)-氨基酸的氨基酸酰基转移酶中筛选出来的，它能立体选择性水解N-乙酰-(D,L)-草铵膦(注：草铵膦是一个非蛋白氨基酸)产生L-草铵膦，选择性接近100％。美国专利US4,226,941(1980)报道了几种微生物菌种及其所含胞内酰基转移酶立体选择性水解N-短链脂肪酰-(D,L)-草铵膦生产L-草铵膦的方法，选择性接近100％。这些短链脂肪酰包括乙酰、丙酰和丁酰等，菌种的催化水解活性与脂肪酰的长度相关，随着链长的增加，细胞催化活性逐渐下降。当底物中酰基供体的链长增加2个，即从乙酰变成丁酰，细胞催化活性下降一半以上。该专利用于分离水解混合物得到纯L-草铵膦的方法是，用强酸性离子交换柱将混合物中未反应的N-短链脂肪酰-D-草铵膦，以及水解生成的短链脂肪酸和L-草铵膦分开。这三种物质水溶性都较好，不能用简单的方法(如萃取)分开，只能用操作复杂、成本高昂的离子交换法分离。由于分离成本在一个完整的产品生产工艺中往往占大头，所以本专利技术在专利技术起始的时候就考虑降低L-草铵膦分离的成本。方法是筛选能立体选择性水解N-长链脂肪酰-(D,L)-草铵膦的菌种，因水解混合物中未反应的N-长链脂肪酰-D-草铵膦，以及水解生成的长链脂肪酸和L-草铵膦这三种物质，只有L-草铵膦易溶于水，另外两种物质(因为含长链脂肪酰)都难溶于水，因此用萃取的方法可以简单地将它们分开。
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种具有很好立体选择性的菌株——假单胞菌(Pseudomonassp.)zjut126及其在选择性水解N-长链脂肪酰-(D,L)-草铵膦(即N-癸酰-(D,L)-草铵膦)生成L-草铵膦中的应用。先将外消旋的(D,L)-草铵膦化学酰化得到外消旋的N-癸酰-(D,L)-草铵膦，再用该菌催化该底物不对称水解生成L-草铵膦。本专利技术从特定环境样品中，以N-癸酰-(D,L)-草铵膦为唯一碳源，筛选到了目标微生物菌种，该菌种的选择性是L型，即能优先水解N-癸酰-L-草铵膦生成L-草铵膦，不能水解N-癸酰-D-草铵膦，选择性接近100％。本专利技术采用的技术方案是：本专利技术提供一株新菌株——假单胞菌(Pesudomonassp.)zjut126，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2017年10月30日，保藏编号CCTCCNO：M2017635，保藏地址：中国，武汉，武汉大学，邮编430072。本专利技术假单胞菌zjut126筛选方法：以外消旋N-癸酰-(D,L)-草铵膦为唯一碳源，先液体培养来自环境样品中的微生物，进行目标微生物的富集，然后将富集培养物涂布在以N-癸酰-(D,L)-草铵膦为唯一碳源的固体培养基平板上，因为N-癸酰草铵膦为白色，难溶于水，平板呈白色不透明状，当它被降解后会形成透明圈，利用该方法可以快速筛选出目标菌株。本专利技术还提供一种所述假单胞菌zjut126在生产L-草铵膦中的应用，具体所述的应用以假单胞菌zjut126经发酵培养获得的湿菌体为催化剂，以外消旋体N-癸酰-(D,L)-草铵膦钠盐为底物，以pH7.5～8.5(优选pH8.0)的磷酸缓冲液为反应介质构成反应体系，在30～35℃、150～200r/min(优选30℃、180rpm)条件下进行草铵膦的拆分反应，反应完全后，获得含(L)-草铵膦和未反应N-癸酰-(D)-草铵膦的反应液，将反应液分离纯化，获得(L)-草铵膦。进一步，所述催化剂用量以湿菌体重量计为3～8g/L反应体系，优选8g/L反应体系，所述底物N-癸酰-(D,L)-草铵膦加入量为2～10g/L反应体系，优选8g/L反应体系。进一步，外消旋N-癸酰-(D,L)-草铵膦钠盐的合成方法为：利用癸酰氯和外消旋(D,L)-草铵膦在碱性条件下反应获得N-癸酰-(D,L)-草铵膦钠盐，具体实验操作步骤如下：(1)向反应器中加入(D,L)-草铵膦铵盐，用质量浓度20％碳酸钠水溶液调节pH到9.0，加热溶解草胺磷，冰浴冷却至0℃，向其中缓慢滴加癸酰氯，优选滴加时间为15分钟；滴加过程中，保持反应体系的温度0℃，并通过滴加质量浓度20％碳酸钠水溶液保持pH在9.0～10.0之间，滴加完后升温至25℃再反应2.5h，获得原溶液；所述草铵膦铵盐与癸酰氯物质的量之比为1:1.2；(2)将步骤(1)原溶液用盐酸酸化至pH值为1.0～2.0，N-癸酰-(D,L)-草铵膦转化为N-癸酰-(D,L)-草铵膦酸，从而与水溶性杂质分开，结晶，抽滤，滤饼用质量浓度10％氢氧化钠乙醇溶液中和至pH值为7.0，抽滤，所得白色粉末状滤饼，即为N-癸酰-(D,L)-草铵膦钠盐。进一步，本专利技术所述湿菌体的制备方法为：(1)斜面培养：将假单胞菌zjut126接种至斜面培养基，30℃培养2天，获得斜面菌体；所述斜面培养基组成为：K2HPO4·3H2O2.1g/L，KH2PO40.4g/L，NaCl0.1g/L，MgSO4·7H2O0.2g/L，CaCl20.025g/L，NH4NO30.5g/L、N-癸酰-(D,L)-草铵膦1.0g/L，琼脂20g/L，溶剂为去离子水，pH值自然；(2)种子培养：将步骤(1)斜面菌体接种至种子培养基，30℃、180rpm培养24h，获得种子液；所述种子培养基组成为：NaCl0.5g/L，KH2PO40.4g/L，K2HPO41.6g/L，NH4Cl1.0g/L，MgSO4·7H2O0本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.假单胞菌(Pesudomonas sp.)zjut126，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2017年10月30日，保藏编号CCTCC NO：M2017635，保藏地址：中国，武汉，武汉大学，邮编430072。

【技术特征摘要】
1.假单胞菌(Pesudomonassp.)zjut126，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2017年10月30日，保藏编号CCTCCNO：M2017635，保藏地址：中国，武汉，武汉大学，邮编430072。2.一种权利要求1所述假单胞菌zjut126在生产L-草铵膦中的应用。3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述应用以假单胞菌zjut126经发酵培养获得的湿菌体为催化剂，以外消旋体N-癸酰-(D,L)-草铵膦钠盐为底物，以pH7.5～8.5的磷酸缓冲液为反应介质构成反应体系，在30～35℃、150～200r/min条件下进行草铵膦的拆分反应，反应完全后，获得含(L)-草铵膦和未反应N-癸酰-(D)-草铵膦的反应液，将反应液分离纯化，获得(L)-草铵膦。4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述反应体系中，催化剂用量以湿菌体重量计为3～8g/L反应体系，所述底物加入量为2～10g/L反应体系。5.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述外消旋N-癸酰-(D,L)-草铵膦钠盐的合成方法为：(1)向反应器中加入(D,L)-草铵膦铵盐，用质量浓度20％碳酸钠水溶液调节pH到9.0，加热溶解草胺磷，冰浴冷却至0℃，向其中缓慢滴加癸酰氯；滴加过程中，保持反应体系的温度0℃，并通过滴加质量浓度20％碳酸钠水溶液保持pH在9.0～10.0之间，滴加完后升温至25℃再反应2.5h，获得原溶液；所述草铵膦铵盐与癸酰氯物质的量之比为1:1.2；(2)将步骤(1)原溶液用盐酸酸化至pH值为1.0～2.0，结晶，抽滤，滤饼用质量浓度10％氢氧化钠乙醇溶液中和至pH值为7.0，抽滤，所得白色粉末状滤饼，即为N-癸酰-(D,L)-草铵膦钠盐。6.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述湿菌体的制备方法为：(1)斜面培养：将假单胞菌zjut126接种至斜面培养基，30℃培养2天，获得斜面菌体；所述斜面培养基组成为：K2HPO4·3H2O2.1g/L，KH2PO40.4g/L，NaCl0.1g/L，MgSO4·7H2O0.2g/L，CaCl20.025g/L，NH4NO30.5g/L、N-癸酰-...

【专利技术属性】
技术研发人员：张朝晖，卫振中，史泰龙，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33