一种Slco1b2基因敲除大鼠的构建方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种Slco1b2基因敲除大鼠的构建方法，利用CRISPR/Cas9系统进行Slco1b2基因敲除大鼠的构建，包括Slco1b2敲除靶点的选择、sgRNA与Cas9mRNA的体外合成与转录、假孕母鼠的准备、单细胞胚胎的体外显微注射与移植、大鼠繁殖与筛选及得到纯合子Slco1b2基因敲除大鼠。经过T7EI核酸内切酶验证，通过本发明专利技术方法制备得到的基因敲除大鼠没有脱靶现象的产生，且在4周左右的F2代敲除大鼠中，总胆红素、直接胆红素和间接胆红素含量均显著性高于野生型大鼠。本发明专利技术还提出了将所述构建方法用于高胆红素血症疾病研究及药物研发中的应用。本发明专利技术为研究治疗胆红素升高等疾病研究提供了有效方法，为药物研发提供了有效实验工具，具有广泛应用前景。

Construction and application of a Slco1b2 gene knockout rat

The invention discloses a construction method of Slco1b2 gene knockout rat, which uses CRISPR/Cas9 system to construct Slco1b2 gene knockout rat, including selection of Slco1b2 knockout target, synthesis and transcription of sgRNA and Cas9 gene in vitro, preparation of pseudopregnant mice, microinjection and transplantation of single-cell embryos in vitro, reproduction and screening of rats and obtaining homozygote Slco1b2 gene knockout rat. \u3002 The T7EI nucleic acid endonuclease showed that the knockout rats prepared by the method of the present invention did not miss the target, and the total bilirubin, direct bilirubin and indirect bilirubin contents in F2 knockout rats of about 4 weeks were significantly higher than those in wild type rats. The invention also proposes the application of the construction method in the research of hyperbilirubinemia diseases and drug development. The invention provides an effective method for studying and treating diseases such as bilirubin elevation, provides an effective experimental tool for drug research and development, and has broad application prospects.

【技术实现步骤摘要】
一种Slco1b2基因敲除大鼠的构建方法及应用
本专利技术属于生物医药
，具体涉及一种Slco1b2基因敲除大鼠的构建方法及应用。
技术介绍
有机阴离子转运多肽(OATPs)是由可溶性载体(SoluteCarrier,SLC)基因编码的12次跨膜蛋白，介导着重要的内源性物质和外源性药物进入细胞。OATPs包含6个亚家族，其中OATP1B亚家族发挥着至关重要的作用，OATP1B亚家族包含OATP1B1和OATP1B3两个家族成员，分别由SLCO1B1(SLC21A6)和SLCO1B3(SLC21A8)基因编码，主要表达在肝脏组织及一些肿瘤组织中。OATP1B1和OATP1B3的底物涵盖范围非常广泛，包括胆红素、胆汁酸、甾体类激素等内源性物质，以及临床上常用的调节血脂、降血栓的他汀类药物，降血压的沙坦类药物以及紫杉醇等抗肿瘤药物。由于大多数药物需要进入肝脏才能被肝细胞代谢，因此由吸收转运体OATP1B1和OATP1B3介导的吸收速率是药物总清除率的一个决定因素。OATP1B1和OATP1B3的活性被抑制，会改变药物的血药浓度，继而产生严重的不良反应。现临床上已报道多个将环孢霉素与他汀类药物连用时产生强烈肌肉毒性的病例。2017年FDA(USFoodandDrugAdministration)发布的“体外由代谢酶和转运体介导的药物-药物相互作用”指导原则中提出，在新药研发过程中，必须要考虑到由OATP1B1和OATP1B3介导的药物-药物相互作用。胆红素作为OATP1B1和OATP1B3的底物，其体内生物转化过程依赖于OATP1B1和OATP1B3的功能，如果两种转运体的功能活性降低或者丧失，会使血液中胆红素含量升高而引起高胆红素血症。罗氏综合征(Rotorsyndrome)是高胆红素血症中的一种，它是一种常染色体隐性遗传病，症状表现为体内OATP1B1和OATP1B3的活性丧失引起的总胆红素和结合胆红素含量升高。由于伦理学原因，许多科学实验无法在人体中进行，需要借助一定的动物模型来模拟、外推人体的情况。最常见的疾病动物模型和药理实验动物模型是啮齿类的小鼠和大鼠。其中，已有的模拟高胆红素血症的动物模型可以分为两类：一类是向大鼠新生鼠体内注射胆红素或者药物，引起大鼠体内胆红素含量升高，此种方法构建的模型胆红素升高是暂时性的，大鼠体内胆红素含量变化大、存留时间短，不能很好的模拟高胆红素持续损害的过程，且对大鼠新生鼠进行注射的操作难度大，不易成功；另一类是基因敲除模型，已有的尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶1A1(UGT1A1)基因敲除小鼠模型可以较好的模拟高胆红素血症，但是模型死亡率非常高，不利于后续的治疗研究。由OATP1B1和OATP1B3的活性丧失引起的Rotorsyndrome是一种相对较轻微的高胆红素血症，若能构建这样一种Rotorsyndrome的疾病模型，那么它可以稳定地表现出胆红素偏高的疾病状态，将为治疗高胆红素血症提供一种有效的实验工具。已有的Slco1b2(与人中SLCO1B1/SLCO1B3同源)基因敲除小鼠模型是基于传统的同源重组的原理，操作复杂，效率低下，实验周期长，而且花费较高。由于大鼠胚胎干细胞难获得、难培养等技术限制，目前还没有关于Slco1b2基因敲除大鼠模型的报道。与小鼠模型相比，大鼠具有很大的优势，如作为疾病模型时体型大、易观察、易操作，且在研究高胆红素血症及黄疸时，目前主要采用大鼠作为疾病模型；做药代动力学实验时大鼠因血量多、耐受性强，可得样本量多等原因也被作为首选的动物模型。因此本专利技术建立Slco1b2基因敲除大鼠模型的方法具备新颖性、必要性及一定的临床前应用价值。CRISPR/Cas9系统作为第三代基因编辑技术，能够快速构建特定大鼠模型。该技术核心原件为Cas9蛋白，通过Cas9蛋白结合成熟的crRNA形成复合物，实现对外源核酸分子的识别和切割。目前，CRISPR/Cas9是基因编辑及模式动物模型构建的最好方法，具有靶向精度高、操作简单的优点，尤其是可以实现多基因同时敲除。
技术实现思路
为了建立高胆红素血症Rotorsyndrome的疾病模型，为治疗胆红素升高等一系列疾病研究提供一种有效的动物模型，也为药物研发过程中提供有效的实验工具，本专利技术在国际上首次提出利用CRISPR/Cas9系统建立Slco1b2基因敲除大鼠模型(即吸收转运体Oatp1b2缺失大鼠模型)的方法及应用。本专利技术提出的Slco1b2基因敲除大鼠的构建方法，基于吸收转运体OATP1B1和OATP1B3在疾病与药物研究中的重要作用，应用CRISPR/Cas9系统建立与人类SLCO1B1/SLCO1B3基因同源的大鼠Slco1b2基因敲除方法，既可以作为高胆红素血症中Rotorsyndrome的疾病研究模型，还可以应用在新药研发及安全性评价工作中。本专利技术提出的Slco1b2基因敲除大鼠的构建方法，利用CRISPR/Cas9系统进行Slco1b2基因敲除大鼠的构建，包括Slco1b2敲除靶点的选择、sgRNA与Cas9mRNA的体外合成与转录、假孕母鼠的准备、单细胞胚胎的体外显微注射与移植、大鼠繁殖与筛选，及得到纯合子Slco1b2基因敲除大鼠。经过T7EI核酸内切酶验证，在所得的基因敲除大鼠中没有脱靶现象的产生。且在4周左右的F2代敲除大鼠中，总胆红素、直接胆红素和间接胆红素含量均显著性高于野生型大鼠。本专利技术提出了一种Slco1b2基因敲除大鼠的构建方法，利用CRISPR/Cas9系统构建Slco1b2基因敲除大鼠，包括以下步骤：1)Slco1b2敲除靶点的选择；2)sgRNA与Cas9mRNA的体外合成与转录；3)将所述Slco1b2基因的sgRNA与Cas9mRNA共注射到体外的受精卵胞浆中，移植至假孕母鼠中，获得F0代大鼠；4)对步骤3)获得的F0代大鼠进行基因型鉴定，筛选得到在Slco1b2敲除靶点附近发生非3整数倍缺失的F0代大鼠；5)将步骤4)筛选获得的F0代大鼠与野生型大鼠合笼，获得F1代大鼠；6)F1代大鼠之间交配，获得Slco1b2基因纯合敲除的F2代大鼠，构建得到Slco1b2基因敲除大鼠种群。其中，所述步骤1)中，选择Slco1b2敲除靶点；利用在线靶点预测网站https://benchling.com选择Slco1b2的敲除靶点。其中，所述Slco1b2基因敲除靶点序列如SEQIDNO.1所示：5'-GCAAACAAGGTTCTGCGA-3’(SEQIDNO.1)。所述Slco1b2基因敲除靶点序列的长度为18bp。其中，所述步骤2)中，体外sgRNA的合成与转录；所述sgRNA模板为包含T7启动子序列和18bp靶点序列的长为60bp的Oligo片段。在体外合成该片段后，以其为模板，通过重叠PCR反应合成完整的sgRNA双链模板，并将双链模板提取分离，然后用T7体外转录试剂盒将sgRNA双链模板在体外进行转录，将转录产物提取分离，得到Slco1b2基因的sgRNA。其中，所述包含Slco1b2基因敲除靶点的Oligo片段序列，如SEQIDNO.2所示：5’-GATCACTAATACGACTCACTATAGGGCAAACAAGGTTCTGCGAGTTTTAGAGCTAGAAA本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种Slco1b2基因敲除大鼠的构建方法，其特征在于，所述方法为利用CRISPR/Cas9系统构建Slco1b2基因敲除大鼠，所述方法包括以下步骤：1)Slco1b2敲除靶点的选择；2)sgRNA与Cas9 mRNA的体外合成与转录；3)将所述Slco1b2基因的sgRNA与Cas9 mRNA共注射到体外的受精卵胞浆中，移植至假孕母鼠中，获得F0代大鼠；4)对步骤3)获得的F0代大鼠进行基因型鉴定，筛选获得在Slco1b2敲除靶点附近发生非3整数倍缺失的F0代大鼠；5)将步骤4)筛选获得的F0代大鼠与野生型大鼠合笼，获得F1代大鼠；6)F1代大鼠之间交配，获得Slco1b2基因纯合敲除的F2代大鼠，构建得到Slco1b2基因敲除大鼠种群。

【技术特征摘要】
1.一种Slco1b2基因敲除大鼠的构建方法，其特征在于，所述方法为利用CRISPR/Cas9系统构建Slco1b2基因敲除大鼠，所述方法包括以下步骤：1)Slco1b2敲除靶点的选择；2)sgRNA与Cas9mRNA的体外合成与转录；3)将所述Slco1b2基因的sgRNA与Cas9mRNA共注射到体外的受精卵胞浆中，移植至假孕母鼠中，获得F0代大鼠；4)对步骤3)获得的F0代大鼠进行基因型鉴定，筛选获得在Slco1b2敲除靶点附近发生非3整数倍缺失的F0代大鼠；5)将步骤4)筛选获得的F0代大鼠与野生型大鼠合笼，获得F1代大鼠；6)F1代大鼠之间交配，获得Slco1b2基因纯合敲除的F2代大鼠，构建得到Slco1b2基因敲除大鼠种群。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中，所述Slco1b2基因敲除靶点序列如SEQIDNO.1所示的5’-GCAAACAAGGTTCTGCGA-3’。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中，所述sgRNA模板是由T7启动子序列和18bp靶点序列组成的长为60bp的Oligo片段；在体外合成该片段后，以其为模板，通过重叠PCR反应合成完整的sgRNA双链模板，并将双链模板提取分离，然后用T7体外转录试剂盒将sgRNA双链模板在体外进行转录，将转录产物提取分离，得到Slco1b2基因的sgRNA；其中，包含Slco1b2基因敲除靶点的Oligo片段序列为：如SEQIDNO.2所示的5'-GATCACTAATACGACTCACTATAGGGCAAACAAGGTTCTGCGAGTTTTAGAGCTAGAAAT-3’。4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤3)中，其中，所述sgRNA和Cas9mRNA的浓度比为1：2。5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤4)中，F0代大鼠基因型鉴定：提取经所述步骤3)共注射的受精卵发育形成的F0代大鼠基因组DNA，设计针对Slco1b2基因靶点附近序列的引物，进行特异性扩增，然后将扩增产物连接到pMD18-T载体上进行测序，鉴定基因具体的突变情况；其中，所述Slco1b2基因靶点附近序列如SEQIDNO.14所示；其中，所述针对Slco1b2基因靶点附近序列的引物为：如SEQIDNO.3所示的上游引物CAGGGTAGACGACCATT；如SEQIDNO.4所示的下游引物...

【专利技术属性】
技术研发人员：王昕，马新润，覃璇，尚旭阳，刘明耀，
申请(专利权)人：华东师范大学，
类型：发明
国别省市：上海,31