CO2休克法诱导产生肿瘤细胞凋亡小体及其抗肿瘤应用制造技术

本发明专利技术涉及一种CO2休克法诱导产生肿瘤细胞凋亡小体及其抗肿瘤应用，所述的凋亡小体是将肿瘤细胞放入不含CO2培养箱中使肿瘤细胞凋亡得到的。本发明专利技术通过控制单个变量、利用分离、纯化技术来收集肿瘤细胞凋亡小体，同时进行体内抗肿瘤试验和体外指标检测。结果表明对所收集的凋亡小体在状态和数量上都有了一个精准的掌握，也具有很强的抗肿瘤作用。

Carbon dioxide shock induces apoptotic bodies in cancer cells and its antineoplastic application

The invention relates to a CO2 shock method for inducing the production of apoptotic bodies of tumor cells and its anti-tumor application. The apoptotic bodies are obtained by putting tumor cells into a CO2-free incubator to induce apoptosis of tumor cells. The invention collects apoptotic bodies of cancer cells by controlling single variables, using separation and purification technology, and carries out in vivo anti-tumor test and in vitro index detection. The results showed that the collected apoptotic bodies had a precise grasp of the status and quantity, and also had a strong anti-tumor effect.

【技术实现步骤摘要】
CO2休克法诱导产生肿瘤细胞凋亡小体及其抗肿瘤应用
本专利技术属于抗肿瘤
，涉及肿瘤细胞凋亡小体，尤其是一种CO2休克法诱导产生肿瘤细胞凋亡小体及其抗肿瘤应用。
技术介绍
目前，肿瘤细胞凋亡小体的获得主要是通过紫外线照射法、热应力法等方法诱导细胞凋亡产生的。但是，这些方法需要控制的变量例如温度、CO2浓度、时间等比较多，会造成结果的不准确。与此同时，通过物理方法制得的全细胞肿瘤疫苗并不能有效地解决肿瘤细胞抗原性弱的问题，因而其免疫活性相对比较低，抗肿瘤效率低。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种CO2休克法诱导产生肿瘤细胞凋亡小体，同时提供了凋亡小体的保存方法、用途及其在抗肿瘤方面的作用。本专利技术解决技术问题所采用的技术方案是：本专利技术提供了一种肿瘤细胞凋亡小体的制备方法，具体操作为：(1)将肿瘤细胞孵育至对数生长期，放入不含CO2的培养箱中以诱导肿瘤细胞凋亡，同时对其进行体外指标检测；(2)细胞凋亡后，收集细胞的培养基上清液，吸入锥形离心管中，在室温下700g～800g离心8min～10min，离心后，为去除上清中残留的混杂细胞，再一次取上清重复离心一次；(3)慢慢的将上清移至10ml的无菌注射器中，安装滤膜过滤装置，给予轻微压力，缓慢使上清通过5μm的滤膜；(4)离心管收集滤液，放入高速离心机中在4℃下，16000g～180000g离心18min～23min；(5)管底灰色沉淀即为纯化的肿瘤细胞凋亡小体。为了消除培养基中的试剂或血清影响，将沉淀重新悬浮并用PBS洗涤，且在16000g～18000g下再离心30min～35min。通过流式细胞分选术或差速离心技术可对所制备的肿瘤细胞凋亡小体进一步纯化。可以使用含有有效成分(如：多酚)的保存剂加入到通常用作细胞培养基的各种培养液中保存凋亡小体。同时也可以寻找一些合适的载体(如：基质、纤维等)，其可适合于凋亡小体的宿主，从而保存肿瘤细胞凋亡小体。可制备含有凋亡小体的组合物，用于临床实验。例如该组合物可施用至有需要的哺乳动物，从而抑制炎症、抑制免疫应答或自身免疫应答等。也可直接利用收集、纯化的肿瘤细胞凋亡小体进行各种临床实验。将所制备的凋亡小体作为抗肿瘤疫苗进行体内抗肿瘤试验，确定其抗肿瘤作用。具体过程如下：建立小鼠肿瘤模型，将制备的凋亡小体进行皮下注射，注射量为25mg/kg左右，一周三次，之后接种肿瘤细胞，进行体内抗肿瘤指标检测。本专利技术的优点和积极效果是：本专利技术针对现有的通过物理方法制备的全细胞肿瘤疫苗活性低的相关缺陷加以改善，进一步验证其抗肿瘤作用。通过控制单个变量、利用分离、纯化技术来收集肿瘤细胞凋亡小体，同时进行体内抗肿瘤试验和体外指标检测。结果表明对所收集的凋亡小体在状态和数量上都有了一个精准的掌握，也具有很强的抗肿瘤作用。附图说明图1为“CO2休克法”作用于HepG2细胞的显微镜观察结果；A、B、C、D分别代表0h、24h、48h、72h图2为HepG2细胞的Hoechst33258染色检测结果；A、B、C、D分别代表0h、24h、48h、72h图3为“CO2休克法”对HepG2细胞周期的影响；A、B、C、D分别代表0h、24h、48h、72h具体实施方式下面结合附图并通过具体实施例对本专利技术作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本专利技术的保护范围。实施例将肝癌细胞HepG2细胞孵育至对数生长期，放入不含CO2培养箱中以诱导肿瘤细胞凋亡；细胞凋亡后，收集细胞的培养基上清液，在室温下800g离心10min,10min后，为去除上清中残留的混杂细胞和细胞碎片，再一次取上清重复离心一次；接着慢慢的将上清移至10ml的无菌注射器中，安装滤膜过滤装置，给予轻微压力，缓慢使上清通过5μm的滤膜；离心管收集滤液，放入高速离心机中在4℃下，16000g离心20min；随后所得的灰色沉淀即为肿瘤细胞凋亡小体。将肿瘤细胞凋亡小体用差速离心技术进行纯化，然后加入保存剂保存，待用。一、体外指标检测(1)倒置显微镜观察细胞形态方法：将HepG2细胞培养至对数期，放入不含CO2的培养箱中分别孵育24h、48h、72h于倒置荧光显微镜中拍照观察。结果见图1，如图1(A)对照组细胞成均匀的菱形状，表面光滑，大小均一，生长状态良好。当培养至24h时，如图1(B)，细胞明显变小而且形状发生改变，已不再是均匀的菱形，细胞膜表面不平整、不圆滑且伴随细胞膜皱缩，可以观察到胞质边集成团；而当培养到48h的时候，如图1(C)，细胞膜皱缩更为严重，出现凋亡小体。当培养时间延长到72h时，图1(D)，视野多为细胞碎片残骸，形态与对照组的细胞形态差距明显，再次说明“CO2休克法”可以使细胞形态发生变化，细胞膜褶皱且出现凋亡小泡。(2)Hoechst单染观察HepG2细胞的凋亡情况原理：Hoechst染色法主要是从形态学水平对细胞凋亡进行检测。Hoechst33258是一种蓝色荧光染料，能够穿透细胞膜与DNA进行特异性结合，其对于死细胞或者固定的细胞能够立刻将其染色，但是，对于活细胞则是循序渐进着染的。当细胞发生凋亡时，细胞内染色质便会发生固缩，经该染料染色后细胞的荧光强度会较正常细胞明显增强。方法：将培养至对数期的HepG2细胞放入不含CO2的培养箱中孵育24h、48h、72h。用胰蛋白酶将其消化，同时与原培养液一起离心(1000r/min，5min)收集细胞，收集的细胞用PBS清洗两次，同时用PBS重悬调整细胞数为5×106个/ml。加入50μLHoechst33258染色液(2.5mg/ml)，37℃避光孵育20min。取出离心，用PBS清洗两次，同时用500μL重悬。将细胞悬液滴于洁净的载玻片上，加上盖玻片后用激光共聚焦显微镜进行观察并拍照。由图2可以明显看出，A中正常细胞核形态规整，呈现出均匀的淡蓝色荧光，用“CO2休克法”处理HepG2细胞之后，随着作用时间的延长，亮蓝色斑点逐渐增多。72h时绝大部分的细胞内都可以看到浓染致密的颗粒状或者块状的蓝色荧光，说明在没有CO2的条件下，HepG2细胞染色质发生固缩，使得Hoechst33258染料和DNA之间的结合增多。实验结果表明，“CO2休克法”可以诱导HepG2细胞形态发生改变，细胞核固缩，且后期产生了凋亡小体。(3)流式细胞仪检测“CO2休克法”对HepG2细胞周期的影响原理：细胞周期可分为G1/G0期，S期和G2/M期。肿瘤细胞在凋亡过程中，核酸内切酶水解DNA分子链内部的磷酸二酯键生成寡聚核苷酸从而降解DNA分子，使DNA链成为小片段，从而从核内漏出，核DNA含量下降，用流式细胞仪检测并分析经PI荧光染色后的细胞，可根据DNA荧光值分析细胞所处的周期阶段，继而统计各个周期阶段细胞数量。利用分析软件对各时期的细胞百分率进行分析，从DNA直方图中可以直观的看出，在二倍体细胞G0/G1峰的前面会有亚二倍体峰(Sub-G1峰)出现。方法：消化收集孵育24h、48h、72h的在不含CO2的情况下培养的HepG2细胞，离心(1000r/min，5min)弃去上清后用PBS清洗两次，同时用PBS重悬调整细胞浓度为1×106个/ml。将细胞悬液逐滴滴入预冷的2ml的无水乙醇(70％)中,本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种CO2休克法诱导产生肿瘤细胞凋亡小体，其特征在于：所述的凋亡小体是将肿瘤细胞放入不含CO2培养箱中使肿瘤细胞凋亡得到的。

【技术特征摘要】
1.一种CO2休克法诱导产生肿瘤细胞凋亡小体，其特征在于：所述的凋亡小体是将肿瘤细胞放入不含CO2培养箱中使肿瘤细胞凋亡得到的。2.根据权利要求1所述的CO2休克法诱导产生肿瘤细胞凋亡小体，其特征在于：制备方法包括如下步骤：(1)将肿瘤细胞孵育至对数生长期，放入不含CO2的培养箱中以诱导肿瘤细胞凋亡；(2)细胞凋亡后，收集细胞的培养基上清液，在室温下离心两次；(3)将上清移至无菌注射器中，安装滤膜过滤装置，给予轻微压力，缓慢使上清通过5μm的滤膜；(4)离心管收集滤液，放入高速离心机中在4℃～6℃下，16000g...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘安军，呂淑明，
申请(专利权)人：庆云堂生物科技北京有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11