凋亡小体疫苗免疫制备广谱抗肿瘤小鼠模型制造技术

本发明专利技术保护一种凋亡小体疫苗免疫制备广谱抗肿瘤小鼠模型，该种小鼠通过凋亡小体疫苗免疫制备，具有广谱抗肿瘤性质。建立方法为：体外通过营养缺失法诱导癌细胞凋亡，获得凋亡小体。用凋亡小体对昆明小鼠进行免疫，每周一次，每只皮下注射25mg/kg凋亡小体，共注射五周。小鼠体内抗肿瘤实验结果显示，对H22荷瘤小鼠抑瘤率可达80.27％，造模成功率达50％。本发明专利技术针对现有免疫抗肿瘤动物实验中，阳性对照建模不合理，而且目前市面上没有广谱免疫抗肿瘤的小鼠等现象。而被凋亡小体免疫的小鼠则解决了这一问题，并且具有更强的抗肿瘤免疫力，而且模型稳定，生产质量高。

【技术实现步骤摘要】
凋亡小体疫苗免疫制备广谱抗肿瘤小鼠模型
本专利技术属于抗肿瘤动物实验研究领域，涉及抗肿瘤动物模型建立的研究，尤其是一种具有广谱抗肿瘤效果的免疫小鼠其制备方法及其在抗肿瘤动物实验中的应用。
技术介绍
作为现代科学技术发展中必不可少的一环，动物实验就是要通过从动物的生命现象中，延伸到人类的生命活动中，探索人类生命奥秘，治愈疾病，延长寿命。由于中国的癌症发病率和死亡率一直在上升，因此很多学者一直努力研究抗肿瘤的药物。现阶段，大多数抗肿瘤药物的动物实验设计中，会将实验动物分为正常组、模型组、阳性对照组以及试验药物组。阳性对照组通常采用抗肿瘤药物如5-氟尿嘧啶(5-Fu)等对荷瘤小鼠进行腹腔注射，抑瘤率达到50％左右。抗肿瘤药物的抑瘤机理为药物直接到达肿瘤细胞上进行杀伤作用，因此可以作为直接对肿瘤细胞发挥杀伤作用的物质，如某些多糖，抗肿瘤实验设计中的阳性对照组。而对于某些药物通过免疫反应，刺激机体发挥免疫作用来杀伤肿瘤细胞的实验设计中，用5-Fu这些抗肿瘤药物处理小鼠则是不合适的。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对现有的抗肿瘤动物实验阳性对照组抗肿瘤效果不稳定，设计不合理等不足，提供一种免疫机理下广谱抗肿瘤小鼠制备及其模型建立，所得模型小鼠抗肿瘤效果好，结果稳定。本专利技术解决其技术问题是采取以下技术方案实现的：一种凋亡小体疫苗免疫制备广谱抗肿瘤小鼠模型，该种小鼠通过凋亡小体疫苗免疫制备，具有广谱抗肿瘤性质。凋亡小体疫苗免疫制备广谱抗肿瘤小鼠模型建立方法为：(1)体外通过营养缺失法诱导癌细胞凋亡，获得凋亡小体。用凋亡小体对昆明小鼠进行免疫，每周一次，每只皮下注射25mg/kg凋亡小体，共注射五周。(2)第六周向实验小鼠的右前肢接种癌细胞，半个月后发现大多数小鼠均无肿瘤生长，并接种另一种癌细胞，发现第二种癌细胞对应的实体肿瘤也未出现，则抗肿瘤小鼠造模成功。而且，所述的营养缺失法诱导肿瘤细胞凋亡获得凋亡小体疫苗的方法为：将肿瘤细胞在缺乏氮源或缺乏碳源或缺乏生长因子的培养基中培养，诱导细胞发生凋亡，将发生凋亡的肿瘤细胞的培养基离心除去死细胞和细胞碎片；将上清液再次离心，得到的沉淀即为凋亡小体疫苗。本专利技术通过“凋亡小体”免疫后得到的广谱抗肿瘤小鼠抗肿瘤机理是，“凋亡小体”接种到小鼠体内后，刺激机体对肿瘤细胞抗原进行识别，待再次接触肿瘤细胞时，免疫细胞能够迅速识别并进行杀伤。这种广谱抗肿瘤小鼠模型的建立，抗肿瘤效果好，且更适合作为免疫药物抗肿瘤动物实验的阳性对照组存在。因此本专利技术同时保护一种凋亡小体疫苗免疫制备广谱抗肿瘤小鼠模型在抗肿瘤药物的动物实验设计中的应用。本专利技术的优点和积极效果是：1、本专利技术提供了一种广谱抗肿瘤小鼠并建立了抗肿瘤小鼠模型，经小鼠体内抗肿瘤实验得到“凋亡小体疫苗”对荷瘤小鼠抑瘤率可达80.27％。造模成功率达50％。2、本专利技术解决了抗肿瘤动物实验中阳性对照设置不合理，造模不稳定，抗肿瘤效果差的不足，建立了一种稳定的免疫抗肿瘤小鼠模型。附图说明图1为“凋亡小体疫苗”免疫后小鼠外周血淋巴细胞亚群的影响(CD3+/CD19+散点图)；图2为“凋亡小体疫苗”免疫后小鼠外周血淋巴细胞亚群的影响(CD4+/CD8+散点图)；图3为“凋亡小体疫苗”免疫后小鼠肿瘤细胞周期分布图。具体实施方式下面结合附图并通过具体实施例对本专利技术作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本专利技术的保护范围。广谱抗肿瘤小鼠的获得方法：在第一批(2-3只)昆明小鼠腹腔内，接种1×107左右个H22小鼠肝癌细胞，使其长为腹水瘤，10天左右，待小鼠腹水瘤生长至对数期后，从腹腔中抽取适量腹水，在无菌条件下以1:5的比例用红细胞裂解液处理掉红细胞，离心后用生理盐水洗涤两次，离心获得H22小鼠肝癌细胞。将H22细胞置于含10％胎牛血清的培养基中，37℃含5％CO2的培养箱中培养，然后用营养缺失法处理H22细胞，诱导其凋亡，获得凋亡小体。对新一批昆明小鼠用凋亡小体进行皮下注射免疫，每周一次，每次注射25mg/kg凋亡小体。第六周时，向小鼠右前肢腋下接种约2×106个H22细胞。两周后将在接种部位未见实体肿瘤的小鼠，再在左前肢腋下接种约2×106个S180小鼠肉瘤细胞。两周后，仍未见实体肿瘤生长，则获得广谱抗肿瘤小鼠，建模成功。1、小鼠体重瘤重脏器指数抑瘤率脾脏是机体最大的免疫器官，含有大量的淋巴细胞和巨噬细胞，具有产生免疫反应的重要功能，血液中抗原在脾中可引起有力的细胞免疫和体液免疫反应，是机体细胞免疫和体液免疫的中心。脾脏肿大后会导致血小板减少、贫血和痛等症状。胸腺是机体的重要淋巴器官，其功能于免疫紧密相关，是T细胞分化、发育、成熟的场所。胸腺的正常萎缩是衰老的一种表现，而癌症的存在会导致胸腺提前萎缩，而癌症等疾病的存在会使得胸腺的异常萎缩，导致机体免疫力降低。将体成熟的雌性昆明小鼠分为空白组(未做任何处理)、模型组(只接种肿瘤细胞未进行免疫)、阳性对照组(接种肿瘤后每天腹腔注射环磷酰胺)和免疫组(接种肿瘤细胞前五周每周一次用25mg/kg凋亡小体进行皮下注射)，凋亡小体免疫组按照剂量每周免疫一次，共免疫5次，最后一次免疫的7天后，在除空白组以外的各组小鼠的右腋下接种S180肿瘤细胞(2×106cells/mL)，21天后实验期结束。试验结束后，将小鼠断颈处死，解剖，取其胸腺、脾脏和肿瘤并称重。结果如表1所示，与空白组相比，模型组小鼠的胸腺指数显著降低(p<0.05)，脾脏指数均有显著升高。这说明肿瘤的存在会导致胸腺萎缩和脾脏肿大。阳性组的胸腺指数甚至显著低于空白组(p<0.05)，而脾脏指数与模型组相比有了显著的升高(p<0.05)，抑瘤率达到了56.94％，这说明抗肿瘤药物虽然能够较好地抑制肿瘤，但是对免疫器官有较大损伤。免疫组胸腺指数和脾脏指数均与空白组相似，与模型组相比，胸腺指数显著升高(p<0.05)，脾脏指数显著降低(p<0.05)，抑瘤率达到了80.27％，显著高于阳性对照组(p<0.05)。这说明“凋亡小体疫苗”免疫能够有效抑制肿瘤细胞的增长，并且对免疫器官具有保护作用。表1小鼠胸腺指数、脾脏指数和抑瘤率注：a与空白组相比较(p<0.05)，b与模型组相比较(p<0.05)，c与阳性组相比较(p<0.05)。2、血清细胞因子水平测定细胞因子(cytokine，CK)是由免疫原或其他刺激剂诱导多种细胞产生的低分子量蛋白质，具有调节固有免疫和适应性免疫、细胞生长等多种功能，可被分为白细胞介素、干扰素、肿瘤坏死因子超家族、生长因子等。IL-2(Interleukin-2)是一种白介素，是免疫系统中的一类细胞生长因子，能调控免疫系统中白血球的细胞活性。γ-干扰素(Interferon-γ,IFN-γ)是I型辅助T细胞(Th1细胞)的标志性的细胞因子，γ-干扰素具有抗病毒、免疫调节及抗肿瘤特性。TNF-α是肿瘤坏死因子的一种，由巨噬细胞分泌产生，具有杀伤或抑制肿瘤细胞以及提高中性粒细胞吞噬能力的作用。将各组小鼠处死前进行眼眶取血操作，用红细胞裂解液裂解血液中的红细胞后，用ELISA试剂盒检测各细本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种凋亡小体疫苗免疫制备广谱抗肿瘤小鼠模型，其特征在于：该种小鼠通过凋亡小体疫苗免疫制备，具有广谱抗肿瘤性质。

【技术特征摘要】
1.一种凋亡小体疫苗免疫制备广谱抗肿瘤小鼠模型，其特征在于：该种小鼠通过凋亡小体疫苗免疫制备，具有广谱抗肿瘤性质。2.根据权利要求1所述的凋亡小体疫苗免疫制备广谱抗肿瘤小鼠模型，其特征在于：建立方法为：(1)体外通过营养缺失法诱导癌细胞凋亡获得凋亡小体疫苗；用凋亡小体疫苗对小鼠进行免疫，每周一次，每只皮下注射20～30mg/kg凋亡小体疫苗，共注射五周；(2)第六周向实验小鼠的右前肢接种癌细胞，半个月后发现大多数小鼠均无肿瘤生长，并接种另一种癌细胞，发现第二种癌细胞...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘安军，王喜玲，
申请(专利权)人：庆云堂生物科技北京有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11