用于地中海贫血检测的探针、基因芯片及制备方法和应用技术

本申请公开了一种用于地中海贫血检测的探针、基因芯片及制备方法和应用。本申请的用于地中海贫血检测的探针的制备方法，包括根据不同地中海贫血基因、修饰基因和不同突变，构建捕获区间库；据此设计捕获探针；捕获区间库包括，alpha基因簇和beta基因簇所有珠蛋白基因及其重要调控区域全长片段、已有记录的断点突变位点、缺失突变中选取的SNP位点，和地贫修饰基因上的SNP位点。本申请的制备方法，针对地贫所有基因簇及其相关基因进行探针设计，使探针能覆盖所有地贫基因突变。结合Tn5建库和高通量测序，不仅能覆盖所有突变，而且操作简便、通量高、成本低，适于地贫大规模人群诊断与筛查，以及新的未知基因突变的研究和预测。

Probe, Gene Chip, Preparation and Application for Thalassemia Detection

The present application discloses a probe, a gene chip, a preparation method and application for detection of thalassemia. The preparation method of the probe applied for detection of thalassemia includes constructing capture interval library according to different thalassemia genes, modified genes and mutations; designing capture probes accordingly; the capture interval library includes all globin genes of alpha gene cluster and beta gene cluster and full-length fragments of their important regulatory regions, recorded breakpoint mutation sites and deletion processes. The SNP loci selected in the mutation and the SNP loci on the modifier genes of the poor. The preparation method of this application is to design probes for all gene clusters and related genes of thalassemia, so that the probes can cover all mutations of thalassemia genes. Combining the construction of Tn5 library and high throughput sequencing, it can not only cover all mutations, but also be easy to operate, high throughput and low cost. It is suitable for the diagnosis and screening of large-scale population in poor areas, as well as the research and prediction of new unknown gene mutations.

【技术实现步骤摘要】
用于地中海贫血检测的探针、基因芯片及制备方法和应用
本申请涉及地中海贫血检测领域，特别是涉及一种用于地中海贫血检测的探针、基因芯片及制备方法和应用。
技术介绍
地中海贫血是全世界最常见的遗传病之一，主要分布于地中海地区、中东、印度、东南亚和非洲。地中海贫血也是中国南方最常见、危害最大的遗传病之一。地中海贫血在热带和亚热带，以及中国东南部的发病率达2.5％-15％。其中，据广东省卫生规划委员会统计的数据显示，广东户籍人口中地贫基因携带率约16.8％，同型地贫基因夫妇约占1.7％，每年有超过5000例重型α地贫和1500例重型β地贫的胎儿出生。根据珠蛋白基因缺陷的种类不同，地贫主要分为α-地中海贫血和β-地中海贫血。α-地中海贫血主要是α珠蛋白基因(16p13.3)发生点突变或拷贝数变异所导致的，其中95％的α-地中海贫血患者是由于α珠蛋白基因大片段缺失所致，即缺失型α地贫。目前已鉴定的α-地贫缺失类型至少有36种，其中中国人占8种。东南亚缺失型(--SEA)、右侧缺失(-α3.7)和左侧缺失(-α4.2)是中国人最常见的3种缺失型。此外，还有68种α珠蛋白基因点突变可导致α-地中海贫血的发生。β-地中海贫血主要是β珠蛋白基因(11p15)发生突变所导致的，主要以点突变及小的插入或缺失为主，也有大片段缺失的报道。目前已报道有200多种β-珠蛋白基因突变可引起β-地中海贫血的发生。此外，α珠蛋白基因的多倍体重复，如αααanti3.7/αα、αααanti4.2/αα，也会增加β地贫临床症状。而β-珠蛋白基因的缺失会对α地贫的表现有修饰作用。地中海贫血是一种单基因遗传病，若夫妻双方为同型地贫基因携带时，其子女有1/4的机会是中重型地贫患者，有1/2的机会跟父母一样是地贫基因携带者，有1/4是正常的胎儿。此外，多数地贫基因携带者可以不表现出任何临床症状，存在隐蔽性。因此，在婚前、孕前和产前开展地贫携带者筛查、并结合遗传咨询与产前诊断，是降低地贫发病率的最为有效的方法。地中海贫血筛查常用的方法有红细胞与血红蛋白检测方法，如红细胞平均体积法、红细胞脆性试验、血红蛋白电泳分析方等，这些方法灵敏性和特异性较差，存在较大的漏诊率与误诊率。目前，最常用的基于地贫基因检测的筛查与诊断方法是Gap-PCR和PCR-RDB，可以检测某地区绝大多数突变和缺失类型，但并不能完全覆盖所有的突变类型，必要时还需采用Real-TimePCR和sanger测序等技术进行诊断，以降低一些罕见地贫突变或缺失类型的漏检率。但是该方案实验操作复杂、检测费用较高、通量低，不适合用于大规模人群的筛查与诊断。另外，还有些使用点杂交方法检测常见的β点突变，如专利申请CN1718742A中公开的“用于诊断β-地中海贫血的核酸杂交膜条及试剂盒”，该试剂盒仅能检测中国常见的17种突变类型；专利申请CN1453363A中公开了“用于诊断地中海贫血的DNA芯片及其制备方法”，仅能检测在中国发现的21种类型的突变；专利申请CN102115781A中公开的检测方法，仅检测27种β地中海贫血区域。这些方法可检测突变谱有限，无法覆盖所有突变类型，并且，仅能检测已知的突变类型，通量较低、成本较高，不适用于地中海贫血大规模人群诊断与筛查。
技术实现思路
本申请的目的是提供一种新的用于地中海贫血检测的探针、基因芯片及其制备方法和应用。本申请采用了以下技术方案：本申请的一方面公开了一种用于地中海贫血检测的探针的制备方法，包括根据不同地中海贫血基因、修饰基因和不同突变，构建捕获区间库；根据捕获区间库设计捕获探针，对捕获区间库进行高质量和高效率的捕获；捕获区间库包括以下区域，(a)alpha基因簇所有珠蛋白基因和重要调控区域，包括HBA1、HBA2、HBZ、HBQ1、HS-40区域，和5’HVR、HVR、3’HVR，针对以上基因全长片段并将其向外延伸70bp作为目标捕获区域；(b)beta基因簇所有珠蛋白基因和重要调控区域，包括HBB、HBD、HBG1、HBG2、HBE1、LCRHS-1、LCRHS-2、LCRHS-3、LCRHS-4和LCRHS-5，针对以上基因全长片段并将其向外延伸70bp作为目标捕获区域；(c)以已有记录的缺失型alpha地贫突变断点及缺失型beta地贫突变断点作为目标捕获区域；(d)以已记录的缺失型alpha突变所涉及的最大的缺失范围为目标，在其范围内，每隔1kb选取1个SNP位点，所选SNP位点在dbSNP中记录的MAF在0.3-0.5之间，同时，所选SNP位点所在序列在基因组上无其它高度同源序列，以所选的SNP位点作为目标捕获区域；(e)以地贫修饰基因上一系列的SNP位点为目标捕获区域，其中，地贫修饰基因包括BCL11A、HBS1L、MYB、KLF1、BCL11A和MYB-HBS1Lintergenic。需要说明的是，本申请的探针制备方法，针对地中海贫血alpha基因簇和beta基因簇的所有珠蛋白基因和重要调控区域，以及所有缺失型alpha地贫突变断点、缺失型beta地贫突变断点、缺失型alpha突变SNP位点，以及地贫修饰基因等一系列的基因和区域进行探针设计，使得制备的探针能够最大程度的覆盖目前所有已知的地中海贫血基因突变；本申请的制备方法获得的探针，不仅能够对所有已知地中海贫血基因突变进行检测，而且还能够用于发现和研究新的地中海贫血基因突变，适用于地中海贫血大规模人群诊断与筛查。还需要说明的是，本申请的制备方法，其关键在于捕获区间库的构建，至于探针的具体设计方案，可以参考现有的基因芯片中探针的设计。为了保障探针设计效果，本申请进一步优选的方案中，对探针设计也进行了限定，详细介绍如下。优选的，捕获探针的长度为50-120bp，捕获探针与杂交区域的变性温度为60-100℃；并且，对于杂交区域的GC含量高于0.6或低于0.3的捕获探针，乘数大于2。其中，乘数大于2是指，理论上所设计的探针的覆盖深度大于2×。更优选的，捕获探针的长度为75bp。更优选的，捕获探针与杂交区域的变性温度为80℃。本申请的另一面公开了本申请的制备方法获得的探针。本申请的另一面公开了本申请的探针在制备用于地中海贫血基因突变检测的基因芯片、试剂盒或检测设备中的应用。本申请的再一面公开了一种用于地中海贫血基因突变检测的基因芯片，该基因芯片上固定有本申请的探针。本申请的再一面公开了一种用于地中海贫血基因突变检测的试剂盒，该试剂盒中含有本申请的探针，或者本申请的基因芯片。需要说明的是，本申请的探针或者基因芯片，可以对地中海贫血进行高通量的检测，并且实验操作简单，且能够覆目前所有已知的地中海贫血基因突变，特别适用于大规模人群的筛查与诊断，因此，可以将探针或基因芯片制成试剂盒，方便使用。不仅如此，本申请的探针或者基因芯片，还能够用于新基因突变的研究和分析，可以作为地中海贫血基因突变研究的工具。本申请的再一面公开了一种地中海贫血基因突变的检测方法，包括采用Tn5转座酶对待测样品的基因组DNA进行文库构建，并采用本申请的探针或基因芯片对所构建的文库进行地中海贫血基因及其相关修饰基因、调控基因或区域进行富集，然后，对富集产物进行高通量测序。需要说明的是，本申请的检测方法，一方面，使用Tn5转座本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于地中海贫血检测的探针的制备方法，其特征在于：包括根据不同地中海贫血基因、修饰基因和不同突变，构建捕获区间库；根据所述捕获区间库设计捕获探针，对所述捕获区间库进行高质量和高效率的捕获；所述捕获区间库包括以下区域，(a)alpha基因簇所有珠蛋白基因和重要调控区域，包括HBA1、HBA2、HBZ、HBQ1、HS‑40区域，和5’HVR、HVR、3’HVR，针对以上基因全长片段并将其向外延伸70bp作为目标捕获区域；(b)beta基因簇所有珠蛋白基因和重要调控区域，包括HBB、HBD、HBG1、HBG2、HBE1、LCR HS‑1、LCR HS‑2、LCR HS‑3、LCR HS‑4和LCR HS‑5，针对以上基因全长片段并将其向外延伸70bp作为目标捕获区域；(c)以已有记录的缺失型alpha地贫突变断点及缺失型beta地贫突变断点作为目标捕获区域；(d)以已记录的缺失型alpha突变所涉及的最大的缺失范围为目标，在其范围内，每隔1kb选取1个SNP位点，所选SNP位点在dbSNP中记录的MAF在0.3‑0.5之间，同时，所选SNP位点所在序列在基因组上无其它高度同源序列，以所选的SNP位点作为目标捕获区域；(e)以地贫修饰基因上一系列的SNP位点为目标捕获区域，其中，地贫修饰基因包括BCL11A、HBS1L、MYB、KLF1、BCL11A和MYB‑HBS1L intergenic。...

【技术特征摘要】
1.一种用于地中海贫血检测的探针的制备方法，其特征在于：包括根据不同地中海贫血基因、修饰基因和不同突变，构建捕获区间库；根据所述捕获区间库设计捕获探针，对所述捕获区间库进行高质量和高效率的捕获；所述捕获区间库包括以下区域，(a)alpha基因簇所有珠蛋白基因和重要调控区域，包括HBA1、HBA2、HBZ、HBQ1、HS-40区域，和5’HVR、HVR、3’HVR，针对以上基因全长片段并将其向外延伸70bp作为目标捕获区域；(b)beta基因簇所有珠蛋白基因和重要调控区域，包括HBB、HBD、HBG1、HBG2、HBE1、LCRHS-1、LCRHS-2、LCRHS-3、LCRHS-4和LCRHS-5，针对以上基因全长片段并将其向外延伸70bp作为目标捕获区域；(c)以已有记录的缺失型alpha地贫突变断点及缺失型beta地贫突变断点作为目标捕获区域；(d)以已记录的缺失型alpha突变所涉及的最大的缺失范围为目标，在其范围内，每隔1kb选取1个SNP位点，所选SNP位点在dbSNP中记录的MAF在0.3-0.5之间，同时，所选SNP位点所在序列在基因组上无其它高度同源序列，以所选的SNP位点作为目标捕获区域；(e)以地贫修饰基因上一系列的SNP位点为目标捕获区域，其中，地贫修饰基因包括BCL11A、HBS1L、MYB、KLF1、BCL11A和MYB-HBS1Lintergenic。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述捕获探针的长度为50-120bp，捕获探针与杂交区域的变性温度为60-100℃；并且，对于杂交区域的GC含量高于0.6或低于0.3的捕获探针，乘数大于2...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵素敏，徐湘民，彭智宇，商璇，茅矛，叶宇华，郭俊甫，魏小凤，阿叁，张倩倩，袁媛，陈超，郭凤禹，李云，陈仕平，卢森，
申请(专利权)人：深圳华大基因股份有限公司，南方医科大学，
类型：发明
国别省市：广东,44