利用条形码式基因芯片检测待检核酸的方法技术

本发明专利技术涉及一种条形码式基因芯片制备方法，采用将特定碱基序列的寡核苷酸片段以微阵列形式固定于基片表面，制备条形码式基因芯片。待检单核苷酸位点特异性的正向引物上游序列与条形码互补配对，中间是限制酶切位点，下游序列与目标序列配对，５’－末端是生物素或荧光基团标记，距离３’－末端上游１－４个核苷酸处引入一个不能与目标序列配对的核苷酸，经聚合酶链式反应、纯化、酶切，与条形码基因芯片杂交洗脱。本发明专利技术条形码碱基序列组成不依赖于待测目标核酸，检测片段长度在３０个核苷酸以内，极大地降低了交叉杂交和错误杂交，通过改变引物中与待检单核苷酸位点处的目标序列配对的下游序列，使条形码基因芯片适合于各种样品的检测。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种新的基因芯片制备方法，尤其涉及一种，可以用于核酸序列分析，属于生物信息工程
为实现这样的目的，在本专利技术中，采用将特定碱基序列的寡核苷酸片段(条形码)以微阵列的形式固定于基片表面，从而制备条形码式基因芯片。单核苷酸多态性(SNP)位点特异性的引物片段上游序列与条形码一一互补配对，下游序列与特定SNP位点的目标序列互补配对，中间是限制酶切位点，5’-末端是生物素或荧光基团标记，距离3’-末端上游1-4个核苷酸处引入一个不能与目标序列配对的核苷酸；利用引物通过聚合酶链式反应扩增目标片段；纯化扩增片段除去未发生扩增的引物片段，并进行限制性酶切；酶切片段与条形码基因芯片杂交检测信号。本专利技术的具体步骤如下第一步，用计算机辅助设计合成条形码寡核苷酸碱基序列，并用各种常规的化学或物理方法将条形码寡核苷酸片段固定于玻片等基片表面，制备条形码基因芯片。将与条形码基因芯片互补配对的检测片段的长度限定在30个核苷酸以内，经过适当的计算机设计和检测片段杂交实验测试，调整导致交叉杂交和错误杂交的条形码序列，使基因芯片上的所有条形码寡核苷酸片段的杂交-洗脱条件兼容，确定最适杂交洗脱条件。第二步，化学合成待检单核苷酸位点特异性的寡核苷酸引物片段。正向引物的序列特征是(1)上游序列即检测片段，与条形码基因芯片上的寡核苷酸片段互补配对。(2)中间是限制酶切位点。(3)下游序列与待检单核苷酸位点处的目标序列配对。(4)5’-末端是生物素或荧光基团标记。(5)3’-末端的核苷酸用于SNP的测定。(6)距离3’-末端上游1-4个核苷酸处引入一个不能与目标序列配对的核苷酸。反向引物可以是随机引物，也可以是特异引物。第三步，聚合酶链式反应(PCR)将正向引物与反向引物、待测目标核酸(模板)、DNA聚合酶、4种脱氧三磷酸单核苷酸(dNTPs)加入PCR反应缓冲液。PCR条件同一般的液相聚合酶链式反应。第四步，PCR产物纯化、限制性酶切。PCR产物用DNA纯化试剂盒纯化，除去未反应的引物片段后，再利用DNA限制性内切酶进行酶切2小时。第五步，杂交将条形码基因芯片在最适杂交条件下与酶切DNA片段进行杂交洗脱。正向引物5’端若是Fluorescein等荧光基团标记，则杂交后直接在相应的检测波长下检测杂交后的条形码基因芯片的荧光强度；若为生物素标记，则与条形码基因芯片杂交后，需用亲和素交联的显色酶显色，观察显色结果。本专利技术与现有的基因芯片技术相比有显著的进步。主要优点如下(1)增加了大通量SNP检测时，杂交的特异性。条形码碱基序列组成不依赖于待测目标核酸，检测片段的长度限定在30个核苷酸以内，极大地降低了交叉杂交和错误杂交(低于10％)，经过适当的计算机设计和实验测试可以除去导致交叉杂交和错误杂交的条形码序列，可使检测准确性达到100％。(2)扩增特异性高。通过在距离引物3’-末端上游1-4个核苷酸处引入一个误配的碱基，使引物的延伸特异性提高，只有3’-末端核苷酸能够与目标序列配对的引物才能够被延伸，完成PCR扩增。(3)适宜于多引物同时进行的反应。反应中可以将针对于不同SNP位点的寡核苷酸引物同时加入，进行反应。(4)检测条件普遍适用。由于杂交的对象是条形码核苷酸序列，杂交条件可以预先确定。通过改变引物中与待检单核苷酸位点处的目标序列配对的下游序列，使条形码基因芯片适合于各种样品的检测，有利于利用基因芯片进行核酸检测的标准化。本专利技术制备的基因芯片可用于检测待测核酸的种类与含量，单核苷酸多态性分析以及疾病诊断等领域。待测样品无需预先用荧光标记，由于与条形码杂交的DNA片段很短，因此可以消除交叉杂交、误杂交现象，大大提高检测的准确度。目标分子可以是DNA、RNA、单链核酸、双链核酸。本实施例为检测一特定DNA片段(模板DNA片段)中某一特定位点的碱基种类。DNA片段的碱基序列与检测碱基位点的序列为3’...........GCAGGCGGCGTACTAGGCCTGCTTGgAGTACA..........ATGCGCGGCTAGCTGCTAGCTAGCT......5’。下画线碱基序列与引物互补配对，小写斜体碱基g为待检SNP位点碱基。一、条形码基因芯片的制备设计条形码寡核苷酸片段，4条条形码碱基序列如下OLIGO 13’-CTGTCTGTCTTTCGAACTC-NH2-5’OLIGO 23’-GAGAGAGAGAAAGGTCGGC-NH2-5’ OLIGO 33’-CCCCCTTTTTGCTTTGCCC-NH2-5’OLIGO 43’-GGGGGAAAAACAAGCTAAC-NH2-5’利用DNA序列合成仪合成条形码寡核苷酸片段，各条片段5’端进行氨基修饰。玻片的氨基化洗净玻片后，于25％的氨水溶液中浸泡过夜，用去离子水冲洗10min，以丙酮清洗。在2％的4-氨丁基三乙氧基硅烷，95％的丙酮溶液中浸泡15min。以新鲜丙酮清洗5次，每次5min。于110℃烘烤45min。氨基化玻片表面异硫氰基化将表面已经氨基化的玻片在异硫氰基化溶液(1mMPDITC，10％无水吡啶和90％无水DMF)中浸泡，室温反应1.5h。然后倒出反应液，用新鲜的异硫氰基化溶液再处理一次。以无水DMF和二氯乙烷分别清洗玻片三次，用氩气将玻片吹干，密闭于惰性气体环境中，4℃避光保存。氨基修饰的条形码寡核苷酸片段的点样及芯片封闭用微量移液器将前面制备好的条形码寡核苷酸片段点样于玻片表面，每点的点样体积为1μl。点样后将玻片置于37℃，90％湿度的恒温恒湿箱中保温过夜，使寡核苷酸片段与玻片充分交联。以水和甲醇清洗，离心干燥。封闭芯片时用10％的氨水于室温浸泡玻片两次，每次1h，最后用水洗两次，离心干燥。4℃避光保存。通过与寡核苷酸片段OLIGO 1-4的互补配对的检测片段进行杂交洗脱实验，确定杂交准确性达到100％的最适杂交洗脱条件。二、SNP位点特异性的寡核苷酸引物片段的设计合成本实施例中的引物序列为primer 15’-fluorescin-GACAGACAGAAAGCTTGAGAATTC CGCATGATCCGGACGACCA-3’primer 25’-fluorescin-CTCTCTCTCTTTCCAGCCGAATTC CGCATGATCCGGACGACCC-3’primer 35’-fluorescin-GGGGGAAAAACGAAACGGGAATTC CGCATGATCCGGACGACCG-3’primer 45’-fluorescin-CCCCCTTTTTGTTCGATTGAATTC CGCATGATCCGGACGACCT-3’Pr imer R5’-TCGATCGATCGTCGATCGG-3’Primer 1-4的5’端序列与条形码OLIGO 1-4互补配对，且5’末端进行荧光基团修饰，3’端序列与目标模板互补配对，且3’端上游第三个碱基C为引入的错配碱基，中间的限制性酶切位点为EcoRI。Primer R为与模板特异性配对的反向引物。同样利用DNA序列合成仪合成特异性引物片段。引物用DNA序列合成仪合成。三、PCR反应将4种正向引物与反向引物、模板、DNA聚合酶、4种dNTPs加入PCR反应缓冲液。PCR条件95℃×5分钟；本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种条形码式基因芯片制备方法，其特征在于包括以下步骤：１）设计合成条形码寡核苷酸碱基序列，并用常规的化学或物理方法将条形码寡核苷酸片段固定于基片表面，制备基因芯片，将与之互补配对的检测片段长度限定在３０个核苷酸以内，调整导致交叉杂交和错 误杂交的条形码序列，使基因芯片上的所有条形码寡核苷酸片段的杂交－洗脱条件兼容，确定最适杂交洗脱条件；２）化学合成待检单核苷酸位点特异性的寡核苷酸引物片段，正向引物的上游序列与条形码基因芯片上的寡核苷酸片段互补配对，中间是限制酶切位点，下 游序列与待检单核苷酸位点处的目标序列配对，５’－末端是生物素或荧光基团标记，距离３’－末端上游１－４个核苷酸处引入一个不能与目标序列配对的核苷酸，反向引物是随机引物或特异引物；３）将正向引物与反向引物、待测目标核酸、ＤＮＡ聚合酶、４种脱 氧三磷酸单核苷酸加入聚合酶链式反应缓冲液，进行反应；４）将反应产物纯化，除去未反应的引物片段后，再利用ＤＮＡ限制性内切酶进行酶切；５）将条形码基因芯片在最适杂交条件下与酶切ＤＮＡ片段进行杂交洗脱。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：刘喜朋，秦胜营，刘建华，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]