一种四环三萜类化合物及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种四环三萜类化合物及其制备方法。本发明专利技术以苦瓜叶为原料，依次采用90％乙醇回流提取、浓缩成浸膏后用乙酸乙酯萃取、硅胶柱色谱分离、高效液相色谱制备、核磁共振结构鉴定等工艺步骤，成功地提取分离得到纯度均大于95％的4种四环三萜类化合物。本发明专利技术方法可分离、纯化得到高纯度的四环三萜类化合物，方法简便易行、重现性好、快速高效且产品纯度高，适用于苦瓜叶中多种类型天然化合物的分离制备，为从苦瓜叶中筛选活性化合物奠定了技术基础。

【技术实现步骤摘要】
一种四环三萜类化合物及其制备方法
本专利技术涉及植物化学领域，具体而言，涉及一种四环三萜类化合物及其制备方法。
技术介绍
苦瓜(MomordicacharantiaL.)又称锦荔枝、凉瓜，为葫芦科(Cucurbitaceae)苦瓜属(Momordica)一年生攀援性草本植物，作为药食同源的瓜类蔬菜，具有增强免疫力、抗糖尿病、抗肿瘤、减肥和抑菌等功效(GroverandYadav,2004；Beloinetal.,2005；Mauryaetal.,2009)。与其他葫芦科作物相比，苦瓜在生长发育过程中很少被植食性昆虫危害，表现出较强的抗虫性。大量研究结果表明，苦瓜茎叶中的苦瓜素(Momordicins)为主要抗虫活性物质。苦瓜素是一类葫芦烷型四环三萜类化合物(tetracyclictriterpeoids)，根据其结构的差异，可以分为MomordicinI、MomordicinII、MomordicinⅢ、MomordicinⅣ和MomordicinⅤ等。其中，MomordicinI和MomordicinII对黑足黑守瓜Aulacophoranigripennis、南瓜黄守瓜Raphidopalpafoveicollos和粘虫Pesudaletiaseparate均有强烈的拒食作用，能显著抑制斜纹夜蛾Spodopteralitura、亚洲玉米螟Ostriniafurnacalish和小菜蛾Plutellaxylostella(L.)生长发育，并对三叶草斑潜蝇Liriomyzatrifolii有显著的拒产卵作用；MomordicinⅣ和MomordicinⅤ对三叶草斑潜蝇也具有产卵趋避作用(Chandravadanaetal.,1987,1997；陈宏，1996；Yasui,1998；Abeetal.,2000；Boekeetal.,2004；Mekuriaetal.,2005,2006；Kashiwagietal.,2007；任立云等，2008；凌冰等，2008,2009；向亚林等，2009；杨舒媚，2010；骆颖等，2012)。苦瓜素类化合物对昆虫的作用方式是多样性的，其结构与现有化学杀虫剂不同，可为创新型结构的杀虫剂提供先导化合物，因此，制备高纯度的葫芦烷型四环三萜类化合物对苦瓜素的开发应用具有重要意义。目前国内外对苦瓜素的分离、纯化研究大部分还处于实验室研究阶段，分离纯化方法主要是采用液-液萃取和经典柱色谱相结合的方法，但这样获得的苦瓜素纯度并不是很高，往往含有其他一些结构相似的杂质，而且工艺复杂，周期长(石雪萍，2006；任立云等，2008；成兰英等，2008；王虎等，2011；李雯等，2012)。有鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的第一目的在于提供一种四环三萜类化合物。本专利技术的第二目的在于提供一种所述的四环三萜类化合物的制备方法。为了实现本专利技术的上述目的，特采用以下技术方案：一种四环三萜类化合物，所述四环三萜类化合物包括如下式(I)-(IV)所示化合物：一种四环三萜类化合物的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：(a)经干燥粉碎所得苦瓜叶粗粉浸提后，得到粗提物；(b)所得粗提物以包括乙酸乙酯内的不同溶剂分别进行萃取；(c)将乙酸乙酯萃取物以淋洗剂进行梯度洗脱，分别收集不同流分；浓缩后，以分析液相色谱进行分析，将保留出峰时间相同的流分合并后浓缩；(d)浓缩所得固体溶解后过滤，然后以半制备液相色谱制备纯化，收集保留出峰时间相同的组分；将相应的色谱柱洗脱液合并后浓缩，得到具有不同结构的四环三萜类化合物。与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：(1)本专利技术制备方法中，采用半制备高效液相色谱法对苦瓜叶乙酸乙酯萃取物洗脱液中葫芦烷型四环三萜类化合物的分离制备，操作简单且快速高效，为葫芦烷型四环三萜类化合物的分离制备与纯化提供了一种重要途径，同时也建立了一种制备样品简单，且能准确快速定性定量检测分析苦瓜素的方法。(2)通过本专利技术制备方法，能够得到四种具有不同结构的高纯度葫芦烷型四环三萜类化合物，这不仅为苦瓜素类化合物杀虫机理的深入研究提供了原料基础，同时也为新结构杀虫剂的开发提供了先导化合物和研究条件。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。图1为本专利技术实施例1半制备色谱图；图2为实施例1化合物1高效液相色谱图；图3为实施例1化合物2高效液相色谱图；图4为实施例1化合物3高效液相色谱图；图5为实施例1化合物4高效液相色谱图。具体实施方式下面将结合实施例对本专利技术的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本专利技术，而不应视为限制本专利技术的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。相较于传统的分离方法而言，制备型高效液相色谱是一种更为有效的分离方式，可用于天然植物活性成分的提取和纯化中(柳娜，2006；王宁等，2013)。也有研究人员采用制备型高效液相色谱对苦瓜果中的抑菌活性物质进行了分离提纯，并得到了两种对金黄色葡萄球菌有显著抑菌效果的活性成分(孟晓，2010)。然而，现有技术中，并没有针对于苦瓜叶中活性成分的提取和有效分离而提出有效的方法。本专利技术有鉴于此，建立了一种适用于对苦瓜叶中四种活性成分进行提取和分离的方法。具体的，本专利技术方法包括如下步骤：(a)待苦瓜成熟采收后，收集苦瓜叶片；然后，将其干燥粉碎，得苦瓜叶粗粉；然后，将苦瓜叶粗粉按照料液比1：10～20(优选为15倍,g/ml)以乙醇溶液(优选浓度为90％，v/v)浸提提取；提取可以采用恒温浸泡的方式进行，提取温度控制在50℃，每次提取时间控制在24h，共进行三次提取；将每次提取后滤液合并，经浓缩(例如蒸发浓缩或减压浓缩等方式)，得到乙醇粗提物(浸膏)；(b)将乙醇粗提物以常规的液-液萃取的方法，进行再次提取，其中，所用有机相分别依次为石油醚，乙酸乙酯，正丁醇，按照有机溶剂-水的“液-液”萃取法，对粗提物进一步提取纯化；经过如上的提取，分别得到石油醚萃取物，乙酸乙酯萃取物，正丁醇萃取物，以及水萃取物。本专利技术所提供的四种具体结构的四环三萜类化合物则大部分存在于乙酸乙酯萃取物中，因而进一步的提取也是以乙酸乙酯提取物作为原料。(c)通过硅胶柱层析法，将乙酸乙酯萃取物以淋洗剂进行梯度洗脱，所用淋洗剂为不同配比的二氯甲烷-甲醇溶液；具体的，梯度洗脱条件为，依次以二氯甲烷：甲醇(v：v)＝100:1、98:1、96:1、90:1、85:1、80:1、75:1、70:1、65:1、60:1、55:1、50:1、45:1、40：1、35:1、30:1、25:1、20:1、15:1、10:1、5:1、2:1、1:1、甲醇(100％)进行梯度洗脱；以每个梯度淋洗剂体积为1计，在洗脱过程中，每收集1/10～1/15体积的洗脱液即作为1个流分进行收集(优选的，每个梯度溶剂为1500mL，每100mL为一个流分)；然后，将所收集的各流分分别进行浓缩(无需浓缩至干)，以分析色谱进行分析，分析色谱条件如下：色谱柱：AgilentTC-C18(4.6×250mm，5μm)；流动本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种四环三萜类化合物，其特征在于，所述四环三萜类化合物包括如下式(I)‑(IV)所示化合物：

【技术特征摘要】
1.一种四环三萜类化合物，其特征在于，所述四环三萜类化合物包括如下式(I)-(IV)所示化合物：2.一种四环三萜类化合物的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：(a)经干燥粉碎所得苦瓜叶粗粉浸提后，得到粗提物；(b)所得粗提物以包括乙酸乙酯内的不同溶剂分别进行萃取；(c)将乙酸乙酯萃取物以淋洗剂进行梯度洗脱，分别收集不同流分；浓缩后，以分析液相色谱进行分析，将保留出峰时间相同的流分合并后浓缩；(d)浓缩所得固体溶解后过滤，然后以半制备液相色谱制备纯化，收集保留出峰时间相同的组分；将相应的色谱柱洗脱液合并后浓缩，得到具有不同结构的四环三萜类化合物。3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(a)中，包括以乙醇溶液对苦瓜叶粗粉浸提的步骤；优选的，苦瓜叶粗粉与乙醇溶液的料液比为1：10～20。4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(b)中，包括采用液液萃取法进行萃取分离的步骤；其中，所用有机溶剂包括石油醚，乙酸乙酯以及正丁醇。5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘欢，凌冰，张茂新，安玉兴，赵欢欢，付建涛，孙东磊，卢颖林，陈立君，龚恒亮，
申请(专利权)人：广东省生物工程研究所广州甘蔗糖业研究所，
类型：发明
国别省市：广东,44