一种凝血酶原突变体蛋白及其编码核酸的应用制造技术

本发明专利技术涉及一种凝血酶原突变体蛋白及其编码核酸的应用，用于制备基因治疗药物，包括将其与启动子和/或终止序列连接并构建表达质粒。本发明专利技术突变体蛋白及其编码核酸具有很高的凝血活性，可以高效地促进血液凝血，提升机体整体凝血功能，具有很好的基因治疗、基因编辑与重组蛋白替代治疗前景。

【技术实现步骤摘要】
一种凝血酶原突变体蛋白及其编码核酸的应用
本专利技术属于出血病治疗领域，特别涉及一种凝血酶原突变体蛋白及其编码核酸的应用。
技术介绍
凝血因子缺陷或其它人体凝血功能障碍时会导致出血性疾病的发生，其中由于凝血因子VIII/IX(FVIII/FIX)缺陷所导致的出血性疾病称之为血友病(甲型/乙型)，重型病人的凝血因子VIII/IX活性往往低于正常的1％，经常发生自发的出血导致肌肉血肿或者关节畸形。输注因子VIII/IX制剂(目前通常是体外重组表达的凝血因子VIII/IX蛋白)补充患者体内的凝血因子VIII/IX水平是目前唯一有效的治疗方法，但是需要频繁的给药。基因治疗是目前正在临床试验的治疗方法，将正常的凝血因子VIII/IX基因导入患者体内表达，从而达到提高凝血因子VIII/IX水平，预防出血的目的。虽然应用重组或血浆来源的FVIII/FIX可以有效地治疗血友病A和B，但是约有30％的病人在治疗后产生抗体，使治疗失效。旁路凝血活性药物是治疗有抑制物产生血友病患者的最佳选择。但是目前临床上应用的凝血因子VIIa(FVIIa)，由于半寿期短(～2小时)，所需剂量大(90～100μg/kg体重)，治疗成本高昂，因此如何获得具有更好治疗效果和药物代谢特点的新型旁路凝血途径药物是目前血友病治疗的一个亟待解决的问题。凝血酶原是凝血反应的核心成分，当其被凝血因子X活化成为具有酶活性的凝血酶后，催化裂解纤维蛋白原称为纤维蛋白，使血液凝固从而达到止血的目的。凝血酶在凝血反应的调节中也发挥重要的作用。在血栓调节蛋白(TM)的协助下，凝血酶将蛋白C裂解活化称为活化的蛋白C(aPC)，后者催化灭活活化的凝血因子V和VIII，从而抑制凝血反应的扩增。因此，生理环境下，凝血酶/凝血酶原在凝血反应中发挥着双重功能，既促进血液凝固，又调节凝血反应，抑制过强的凝血反应发生，导致血栓形成。凝血酶在循环中迅速被其抑制物，如抗凝血酶(ATIII)灭活，从而使凝血反应终止。凝血酶原复合物(包括凝血酶原，凝血因子IX,凝血因子X，凝血因子VII)也被应用于血友病，特别是有抑制物存在的血友病的治疗，但是效果并不理想。在血友病患者中应用凝血酶原后，除被活化促进凝血反应外，也可以活化蛋白C，抑制凝血反应，削弱了凝血酶原的止血治疗效果。同时，由于凝血酶会迅速被抗凝血酶灭活，也限制了凝血酶原的在血友病患者中的止血效果。因此，如何对凝血酶原进行改造，使其具有促凝功能的选择性，也即是在保有促进纤维蛋白原转化为纤维蛋白的活性的同时，削弱活化蛋白C抗凝的活性；同时，延长凝血酶的半寿期，对抗凝血酶的抑制能力产生抵抗，也可以提升凝血酶原在出血病中的治疗效果。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种凝血酶原突变体蛋白及其编码核酸的应用，该突变体凝血活性高，具有很好的基因治疗与重组蛋白替代治疗前景。本专利技术提供了一种凝血酶原突变体蛋白及其编码核酸的应用，应用凝血酶原突变体的核苷酸序列于制备基因治疗药物，包括将其与启动子和/或终止序列连接并构建表达质粒。本专利技术还提供了一种凝血酶原突变体蛋白及其编码核酸的应用，应用突变体蛋白(凝血酶原R541W蛋白)及其编码核酸于基因编辑的病毒、非病毒载体或模板。本专利技术还提供了一种凝血酶原突变体蛋白及其编码核酸的应用，应用突变体蛋白(凝血酶原R541W蛋白)于制备血友病或其他出血性疾病的重组蛋白治疗药物。本专利技术还提供了一种凝血酶原突变体蛋白及其编码核酸的应用，应用突变体蛋白(凝血酶原R541W蛋白)于制备凝血酶原R541W突变体融合蛋白，并将其施用于血友病或其他出血性疾病的重组蛋白治疗药物。所述融合蛋白为人白蛋白、免疫球蛋白Fc、转铁蛋白或alpha1抗胰蛋白酶。凝血酶原突变体的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示，位于1621位的核苷酸为T而非C；凝血酶原突变体蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示，位于541的氨基酸为Trp而非人野生型凝血酶原hFII的Arg；或是任意其他氨基酸在该位点的改变。本专利技术还提供了一种凝血酶原突变体的核酸，或与所述编码核酸长度相同且与所述编码核酸完全互补的核酸。本专利技术还提供了一种凝血酶原突变体蛋白的制备方法，包括如下步骤：(1)将人野生型或凝血酶原R541W突变的人凝血酶原基因连入载体中，得到重组载体；(2)将上述重组载体转化宿主细胞，得到表达重组凝血酶原R541W突变细胞克隆；(3)于无血清培养基中连续灌流培养上述重组细胞克隆，诱导重组凝血酶原R541W的突变体蛋白的表达；(4)分离纯化、过滤，最后灌装、冻干，得到所表达的凝血酶原R541W突变体蛋白。所述步骤(3)中的无血清培养基为“SAFCBiosciencesEX-CELLTM302”(商品化的试剂)。所述步骤(4)中的纯化包括初纯和精纯。本专利技术还提供了一种表达突变蛋白(凝血酶原R541W)的质粒载体进行基因转导，其制备和检验包括如下步骤：(1)将编码凝血酶原R541W的cDNA连接入含CMV启动子的pcDNA3.1质粒。(2)将纯化的表达凝血酶原R541W的质粒载体150μg溶于2mL生理盐水经鼠尾静脉高压注射入4-8周的A型血友病小鼠体内。注射同体积PBS为阴性对照。(3)注射48小时后，眼眶采血应用凝固法检测凝凝血酶原活性，ELISA法检测凝血酶原抗原。(4)注射后72小时，直径2mm处断尾，置于温生理盐水中观察10分钟内出血情况。通过检测血红蛋白量估测出血量，以缓冲液注射组出血量为100％，比较不同质粒转导后的血友病小鼠断尾后出血量。(5)心脏取血进行血栓弹力图检测。本专利技术的核酸或氨基酸序列的药物组合物或基因治疗载体，用于诊断，预防和/或治疗疾病，其中所述疾病主要包括出血性疾病或各种原因导致的出血；其中，最可能的出血性疾病是血友病A和B，即由于遗传性凝血因子VIII或IX缺乏导致的出血性疾病，并包括其中有抑制性抗体产生的血友病A和B，或者后天因抑制物产生所导致的获得性凝血因子VIII或IX缺乏；及其它使用旁路制剂的出血性疾病，例如新生儿凝血障碍；严重的肝脏疾病；高风险手术；创伤性失血；骨髓移植；血小板减少症和血小板功能障碍；口服抗凝的紧急逆转；先天性凝血因子V，VII，X和XI的缺陷；血管性血友病，及血管性血友病因子抑制物导致的获得性血管性血友病，与大量损伤有关的失血，大脑出血，血小板功能障碍。有益效果本专利技术的凝血选择性高活性凝血酶原突变体，具有选择性促凝活性，在被转化称为凝血酶后，仍有很强的凝血活性，但是对抗凝系统的作用显著减弱，对抗凝血酶的灭活产生抵制，从而对凝血反应产生更高的促进作用，提升机体整体凝血功能。该凝血酶原突变体可以用于包括血友病(凝血因子IX/凝血因子VIII缺陷)(存在或不存在抑制物)等出血性疾病的治疗，具有很好的基因治疗与重组蛋白替代治疗前景。附图说明图1为本专利技术载体结构的示意图；图2a和b为重组凝血酶原R541W促凝及活化蛋白C的示意图；图3a和b为重组凝血酶原R541W体外纠正凝血因子VIII/IX缺陷血浆凝血酶生成示意图；图4为重组凝血酶原R541W处理后，血友病A小鼠断尾后生存率示意图。具体实施方式下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。此外应理本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种凝血酶原突变体蛋白及其编码核酸的应用，其特征在于：应用凝血酶原突变体的核苷酸序列于制备基因治疗药物，包括将其与启动子和/或终止序列连接并构建表达质粒。

【技术特征摘要】
1.一种凝血酶原突变体蛋白及其编码核酸的应用，其特征在于：应用凝血酶原突变体的核苷酸序列于制备基因治疗药物，包括将其与启动子和/或终止序列连接并构建表达质粒。2.一种凝血酶原突变体蛋白及其编码核酸的应用，其特征在于：应用突变体蛋白及其编码核酸于基因编辑的病毒、非病毒载体或模板。3.一种凝血酶原突变体蛋白及其编码核酸的应用，其特征在于：应用突变体蛋白于制备血友病或其他出血性疾病的重组蛋白治疗药物。4.一种凝血酶原突变体蛋白及其编码核酸的应用，其特征在于：应用突变体蛋白于制备凝血酶原R541W突变体融合蛋白，并将其施用于...

【专利技术属性】
技术研发人员：王学锋，武文漫，丁秋兰，
申请(专利权)人：上海交通大学医学院附属瑞金医院，王学锋，武文漫，丁秋兰，
类型：发明
国别省市：上海,31