一种高效液相色谱检测生物制品中苯酚含量的方法技术

本发明专利技术公开了一种高效液相色谱检测生物制品中苯酚含量的方法，属于苯酚含量检测的技术领域，主要包括仪器检查、检测前准备、苯酚洗脱、绘制线性回归方程以及苯酚含量测定等步骤，其以TFA‑乙腈溶液和TFA‑水溶液之间的体积比的不同分成多个洗脱阶段，依次对样品中的苯酚进行梯度洗脱并测定其含量，具有检测误差小、灵敏度高的特点，从而提高了对苯酚含量检测的精确度。

A method for determination of phenol in biological products by high performance liquid chromatography

The invention discloses a method for detecting phenol content in biological products by high performance liquid chromatography, which belongs to the technical field of phenol content detection. It mainly includes the steps of instrument inspection, preparation before detection, phenol elution, drawing linear regression equation and phenol content determination. The method is divided into several elution stages according to the volume ratio between TFA acetonitrile solution and TFA aqueous solution. The gradient elution and determination of phenol content in the sample have the characteristics of small detection error and high sensitivity, thus improving the accuracy of the detection of phenol content.

【技术实现步骤摘要】
一种高效液相色谱检测生物制品中苯酚含量的方法
本专利技术属于苯酚含量检测的
，特别涉及一种高效液相色谱检测生物制品中苯酚含量的方法。
技术介绍
苯酚(Phenol，C6H5OH)是一种具有特殊气味的无色针状晶体，是生产某些树脂、杀菌剂、防腐剂以及药物(如阿司匹林)的重要原料，也可用于消毒外科器械和排泄物的处理，还可以用于皮肤杀菌、止痒和中耳炎等，具有广泛的应用范围。在生物制品的制备过程中，苯酚是一种优良的杀菌剂，其作用机理为苯酚能够裂解并穿透细胞壁，与菌体蛋白结合，引起蛋白变性，进而实现菌体的灭活。然而，由于苯酚毒性较大，苯酚在生物制品中对生物制品的质量也会产生一定的影响，因此在中间产品加工为成品之前需要对中间产品中的苯酚含量加以测定。现行2015版中国药典中，苯酚含量的测定采用的是溴量滴定法，该方法主要用于测定芳香胺族和酚类有机物。然而，生物制品中通常还混有少量在苯环上带有羟基和氨基结构的物质，其邻位和对位氢易发生溴代反应，从而造成检测得到的含量比实际的大，使得其检测误差较大、灵敏度不足。另外，其在滴定终点时需要人为观察判断其颜色消失的时机，而滴定时滴定液最终一滴会直接对检测结果存在较大的影响，因此存在人为操作偏差。
技术实现思路
针对现有技术存在的不足，本专利技术的目的在于提供一种高效液相色谱检测生物制品中苯酚含量的方法，其以TFA-乙腈溶液和TFA-水溶液之间的体积比的不同分成多个洗脱阶段，依次对样品中的苯酚进行梯度洗脱，并测定其含量，具有检测误差小、灵敏度高的特点，从而提高了苯酚含量检测的精确度。为实现上述目的，本专利技术提供了如下技术方案：一种高效液相色谱检测生物制品中苯酚含量的方法，包括以下步骤：①仪器检查：按初始体积比将流动相A和流动相B接入高效液相色谱仪的色谱柱中加以平衡，检查高效液相色谱仪的各个系统，确保仪器正常，其中，流动相A为TFA-乙腈溶液，流动相B为TFA-水溶液；②检测前准备：设置高效液相色谱仪的色谱条件，随后继续按初始体积比将流动相A和流动相B接入色谱柱中，直至色谱柱中流动相A和流动相B的混合物达到动态平衡；③苯酚洗脱：将样品加入至步骤②中已平衡的色谱柱中，按流动相A和流动相B之间的体积比的不同分成多个洗脱阶段，依次对样品中的苯酚进行梯度洗脱，测得苯酚的吸收峰面积；④绘制线性回归方程；精密量取多组已知浓度的苯酚标准溶液作为标准对照液，将各组标准对照液分别按照步骤③中的洗脱阶段进行梯度洗脱，以标准对照液浓度为横坐标、以吸收峰面积为纵坐标制作线性回归方程；⑤、苯酚含量测定：将步骤③所得的苯酚的吸收峰面积代入步骤④的线性回归方程中，计算得到样品中苯酚的含量。本专利技术通过高效液相色谱法检测苯酚含量，其利用样品中各物质在色谱柱内的洗脱速度的不同，使得各物质洗脱的时间存在差异，随后再对苯酚的含量加以针对性测定，相对于溴量滴定法，减少了因人为判定检测终止时间而使得检测结果出现操作偏差的可能性，具有检测误差小、灵敏度高的特点，从而提高了苯酚含量检测的精确度。其中，步骤①能够在确保色谱仪正常后保持在平稳状态，为样品测定提供充足的准备工作，使得苯酚含量测定更加顺利。步骤②中流动相用TFA-乙腈溶液和TFA-水溶液，TFA为三氟乙酸，其通过与疏水的键合相和残留的极性表面以多种模式相互作用，进而改善峰形、克服峰展宽和拖尾问题；乙腈是常用的流动相分离分子，具有低UV背景吸收、洗脱基线优良、低固体颗粒和挥发残留、高批次稳定性的特点，能够有效减少出现鬼峰、色谱柱的堵塞、高次品率的状况，从而能够准确地对苯酚含量加以测定。步骤③中TFA-乙腈溶液和TFA-水溶液按不同体积比对样品中的苯酚加以梯度洗脱，能够将样品中的苯酚以及与苯酚结构相近的物质逐一分离，最后再通过步骤④和⑤对苯酚含量加以计算测定，从而有效提高苯酚含量检测的准确度，便于人们对样品质量的监控。综上，采用本专利技术的方法测定样品中苯酚的含量，具有检测误差小、灵敏度高、精确度高的特点。进一步地，步骤①中，TFA-乙腈溶液的体积浓度为1.0‰。进一步地，步骤①中，TFA-水溶液的体积浓度为1.0‰。TFA是一种羧酸，常规的高效液相色谱法中TFA的添加量在1.0％左右，而苯酚在强酸中极易氧化，进而影响苯酚含量检测的精准度；本申请的专利技术人出人意料地发现(或经过大量实践证实)，当TFA-乙腈溶液和TFA-水溶液的体积浓度均为1.0‰时，能够有效减少苯酚的氧化，同时又能保证其形成的流动相能较好地在色谱柱中流通，从而能够精准地对样品中苯酚含量加以测定，另外能够减少流动相中TFA的使用量，降低苯酚含量检测的成本。进一步地，步骤②中，所述色谱条件中色谱柱的柱温为24℃。通过采用上述技术方案，常规的高效液相色谱法在检测物质含量时，其色谱柱的柱温为30℃，苯酚易挥发，高温状态下容易被流动相带出而影响其含量测定，通过降低柱温能够减少苯酚的挥发。然而温度降低过多会使得流动相的粘度有所增加，柱温在24℃时，能够保证流动相良好的流动效率，同时能够减少苯酚的挥发，进而有效提高了苯酚含量测定的精准度。此外，24℃的柱温还能在一定程度上减少高效液相色谱仪在洗脱过程中对色谱柱加温的能耗，从而有助于降低高效液相色谱仪的运行成本。进一步地，步骤②中，所述色谱条件中流动相的流速为0.5-1.0mL/min。通过采用上述技术方案，当流动相中的流速为0.5-1.0mL/min时，样品中的各物质能够较好地实现分离，形成的色谱图较为清晰，从而便于对苯酚所在吸收峰的面积的计算。进一步地，步骤③中，所述样品的洗脱分为七个阶段，按体积百分数计，依次为：0-6min：3.0％的流动相A+97.0％的流动相B；6.01-12min：15.0％的流动相A+85.0％的流动相B；12.01-18min：40.0％的流动相A+60.0％的流动相B；18.01-24min：65.0％的流动相A+35.0％的流动相B；24.01-30min：85.0％的流动相A+15.0％的流动相B；30.01-40min：100.0％的流动相A+0.0％的流动相B；40.01-50min：3.0％的流动相A+97.0％的流动相B。通过采用上述技术方案，将样品的洗脱分成上述七个阶段，其中苯酚在第12.01-18min时被有效洗脱，以此分阶段和梯度洗脱的方法能够使得样品中的物质被逐一洗脱，有效提高了苯酚含量检测的准确度，具有检测误差小、灵敏度高的特点。另外，上述阶段洗脱的方法还便于对不同组样品的连续检测，有助于提高其检测效率。进一步地，步骤③中，所述样品中苯酚的含量为5-60μg/mL。通过采用上述技术方案，在测定吸光度时，当待测品中苯酚含量在5-60μg/mL之间，则流动相对苯酚的干扰可以忽略不计，进而使得检测苯酚含量的准确度较高。进一步地，步骤③中，步骤③中，所述样品的进样量为40-100μL。通过采用上述技术方案，进样量过少容易出现苯酚含量过少而难以形成吸收峰的状况，进样量过多则容易出现样品处理时间过长、流动相损耗增加的状况，因此选用进样量40-100μL为宜。进一步地，步骤③中，所述样品为待测品经孔径为0.45μm的滤膜过滤后所得。通过采用上述技术方案，待测品经过孔径为0.45μm的滤膜过滤后，待测品中的大颗粒物质能够被有效去除本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种高效液相色谱检测生物制品中苯酚含量的方法，包括以下步骤：①仪器检查：按初始体积比将流动相A和流动相B接入高效液相色谱仪的色谱柱中加以平衡，检查高效液相色谱仪的各个系统，确保仪器正常，其中，流动相A为TFA‑乙腈溶液，流动相B为TFA‑水溶液；②检测前准备：设置高效液相色谱仪的色谱条件，随后继续按初始体积比将流动相A和流动相B接入色谱柱中，直至色谱柱中流动相A和流动相B的混合物达到动态平衡；③苯酚洗脱：将样品加入至步骤②中已平衡的色谱柱中，按流动相A和流动相B之间的体积比的不同分成多个洗脱阶段，依次对样品中的苯酚进行梯度洗脱，测得苯酚的吸收峰面积；④绘制线性回归方程；精密量取多组已知浓度的苯酚标准溶液作为标准对照液，将各组标准对照液分别按照步骤③中的洗脱阶段进行梯度洗脱，以标准对照液浓度为横坐标、以吸收峰面积为纵坐标制作线性回归方程；⑤苯酚含量测定：将步骤③所得的苯酚的吸收峰面积代入步骤④的线性回归方程中，计算得到样品中苯酚的含量。

【技术特征摘要】
1.一种高效液相色谱检测生物制品中苯酚含量的方法，包括以下步骤：①仪器检查：按初始体积比将流动相A和流动相B接入高效液相色谱仪的色谱柱中加以平衡，检查高效液相色谱仪的各个系统，确保仪器正常，其中，流动相A为TFA-乙腈溶液，流动相B为TFA-水溶液；②检测前准备：设置高效液相色谱仪的色谱条件，随后继续按初始体积比将流动相A和流动相B接入色谱柱中，直至色谱柱中流动相A和流动相B的混合物达到动态平衡；③苯酚洗脱：将样品加入至步骤②中已平衡的色谱柱中，按流动相A和流动相B之间的体积比的不同分成多个洗脱阶段，依次对样品中的苯酚进行梯度洗脱，测得苯酚的吸收峰面积；④绘制线性回归方程；精密量取多组已知浓度的苯酚标准溶液作为标准对照液，将各组标准对照液分别按照步骤③中的洗脱阶段进行梯度洗脱，以标准对照液浓度为横坐标、以吸收峰面积为纵坐标制作线性回归方程；⑤苯酚含量测定：将步骤③所得的苯酚的吸收峰面积代入步骤④的线性回归方程中，计算得到样品中苯酚的含量。2.根据权利要求1所述的一种高效液相色谱检测生物制品中苯酚含量的方法，其特征在于，步骤①中的TFA-乙腈溶液的体积浓度为1.0‰。3.根据权利要求1或2所述的一种高效液相色谱检测生物制品中苯酚含量的方法，其特征在于，步骤①中的TFA-水溶液的体积浓度为1.0‰。4.根据权利要求1所述的一种高效液相色谱检测生物制品中苯酚含量的方法，其特征在于，步骤②中，所述色谱条件中色谱柱的柱温为24℃。5.根据权利要求1所述的一种...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹方，朱复培，王良超，李强，马伟，严世鑫，杨欢，胡文龙，王磊，
申请(专利权)人：艾美卫信生物药业浙江有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33