检测异黄酮类化合物的方法技术

本发明专利技术公开了检测异黄酮类化合物的方法。该方法包括：将待测样品利用醇溶液进行提取处理，以便得到提取液；以及利用超高性能超临界流体色谱‑串联质谱对所述提取液进行检测处理，以便获得所述异黄酮类化合物的含量。该方法操作简单、重现性好、分析速度快、灵敏度高，并实现基线分离，可以对多种常用异黄酮成分进行定量分析和鉴定。

Detection of Isoflavones

The invention discloses a method for detecting isoflavones. The method includes: extracting and treating the sample to be tested with alcohol solution in order to obtain the extract; and detecting and treating the extract with ultra-high performance supercritical fluid chromatography and tandem mass spectrometry in order to obtain the content of the isoflavones. The method is simple, reproducible, fast and sensitive. Baseline separation can be achieved. Quantitative analysis and identification of various commonly used isoflavones can be carried out.

【技术实现步骤摘要】
检测异黄酮类化合物的方法
本专利技术涉及分析化学领域，具体地，涉及检测异黄酮类化合物的方法。
技术介绍
异黄酮是具有常见3-苯基-色烯-4-酮骨架的天然化合物。当比较异黄酮的结构与常规黄酮类化合物时，不同之处在于前者的苯基在色烯部分的C-3处被取代，而后者在C-2位置被取代。由于它们与雌二醇的结构相似，异黄酮作为酚类植物雌激素在调节雌激素受体中起重要作用，呈现雌激素和抗雌激素作用。因此，异黄酮已被广泛用作预防与年龄相关和雌激素依赖性疾病如更年期综合征的补救措施。除了它们的激素样活性外，异黄酮还具有其他药理活性，如抗真菌，抗菌，抗氧化，抗炎，抗癌，抗肥胖，抗糖尿病活性。从分析和药理学的角度来看，活性成分可以作为草药质量评估的一种措施，异黄酮的定量测定有助于确认安全有效地使用富含异黄酮的草药。为此，已有文献报道了采用毛细管电泳(CE)，薄层色谱(TLC)和高效液相色谱(HPLC)等一系列方法进行测定。由于低分辨率(TLC)或重复性差(CE)，这些方法使用较少。因此，与PDA，MS或MS/MS联用的HPLC方法更常用于异黄酮的分析。然而，这些方法通常会遇到高有机试剂消耗和长时间消耗(大约30-90分钟)，后者是需要高通量分析时的主要瓶颈。UHPLC柱的分析时间较短(12分钟或更短)，但由于相同的分离机制，一些结构相似的异黄酮的分离并不理想。因此，有必要开发一种基于不同分离机制的异黄酮类化合物的分析方法，以节省时间。
技术实现思路
本专利技术旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本专利技术的一个目的在于提出一种检测异黄酮类化合物的方法，该检测方法操作简单、重现性好、分析速度快、灵敏度高，并实现基线分离，可以对多种常用异黄酮成分的定量分析/鉴定。需要说明的是，本专利技术是基于专利技术人的下列工作而完成的：超高性能超临界流体色谱(UHPSFC)由于不同的相互作用机制可以作为UHPLC的补充技术。UHPSFC可用的固定相种类很多，并且具有广泛的选择性，流动相中水含量低或没有水也影响分析物与固定相之间的相互作用机制。目前，具有亚2μm颗粒固定相的UHPSFC已被广泛使用，因为它可以很容易地实现快速分析和增强的色谱分离。与UHPSFC结合的检测器很多。光电二极管阵列检测器(PDA)经常用于许多天然产品的常规定量。然而，特别难以消除植物基质(含有数千种化合物)的干扰，以准确分析许多异黄酮，这通常会导致假阳性错误。例如，在我们以前的研究中，已经建立了用于分离血清中的12种异黄酮的UHPSFC-PDA方法，但是当我们增加异黄酮的数量时，该方法未能实现所有分析物的基线分离，这导致了当植物样品被定量时不准。同时，几种异黄酮在特定植物材料中的含量非常低，PDA无法检测到。由于这些原因，UHPSFC需要与更具选择性和灵敏度的探测器耦合。专利技术人发现，三重四极杆质谱(QqQMS/MS)可以提供足够的结构信息，并使用多反应监测(MRM)模式对植物基质中的多种化合物进行准确而灵敏的定量。MRM模式可以提供选择性和灵敏的增益，因为二级意味着每种目标化合物的离子对的两种不同特征。同时，由于减少了杂质干扰，样品制备过程可以简化，避免了耗时和复杂的纯化过程。然而，MS的缺点是它不能区分相同分子量的共洗脱异黄酮。因此，仍然需要实现异黄酮同分异构体的基线分离。由于操作简单，成本低，PDA检测更适合于检测不同色谱条件下异黄酮分离的质谱检测。因此，专利技术人尝试将PDA与MS结合用于UHPSFC中的方法开发。专利技术人创造性地将UHPSFC与质谱联用分析异黄酮，成功开发了一种快速，灵敏的检测方法，用UHPSFC-QqQ-MS/MS测定16种异黄酮。优化影响UHPSFC的参数以在短的分析时间内良好地分离异黄酮异构体。此外，通过使用MRM模式的MS检测实现了优异的选择性和灵敏度，这允许对16种异黄酮进行令人满意的鉴定和定量。这些目标化合物的质谱裂解途径表明，前体离子和产物离子均以质子化分子的形式以及自由基阳离子形式存在。最后，该方法成功地适用于通过简单的超声波溶剂萃取，来检测植物材料中的异黄酮。该方法快速，灵敏，可用于葛根(野葛)及其同缘种粉葛、苦葛中异黄酮的测定。本专利技术实施例的检测异黄酮类化合物的方法可准确用于分析食品，生物和其他植物样品中异黄酮的含量。因而，根据本专利技术的一个方面，本专利技术提供了一种检测异黄酮类化合物的方法。根据本专利技术的实施例，该方法包括：将待测样品利用醇溶液进行提取处理，以便得到提取液；以及利用超高性能超临界流体色谱-串联质谱对所述提取液进行检测处理，以便获得所述异黄酮类化合物的含量。根据本专利技术实施例的检测异黄酮类化合物的方法，操作简单、重现性好、分析速度快、灵敏度高，并实现基线分离，可以对多种常用异黄酮成分进行定量分析和鉴定。另外，根据本专利技术上述实施例的检测异黄酮类化合物的方法还可以具有如下附加的技术特征：根据本专利技术的实施例，待测样品可以是食品、生物和植物。本专利技术实施例的方法，可以用于多种样品的检测。根据本专利技术的实施例，超高性能超临界流体色谱可以是AcquityUPC2系统。根据本专利技术的实施例，所述提取处理包括：将所述待测样品用20-40％甲醇溶液萃取24-40分钟，以便得到萃取液；将所述萃取液进行蒸发处理，以便得到蒸发后残渣；以及将所述蒸发后残渣溶于甲醇中，以便得到所述提取液。由此，通过萃取得到的异黄酮即可用于后续检测处理，提取方法简单，并且，能有效从待测样品中充分提取异黄酮化合物。根据本专利技术的实施例，所述待测样品与所述甲醇溶液按0.1g：20-40ml的比例进行所述萃取，优选地，可以按0.1g：30ml的比例进行所述萃取，由此，萃取效果好，有利于充分从待测样品中提取异黄酮化合物。根据本专利技术的实施例，所述超高性能超临界流体色谱-串联质谱中的质谱为三重四极杆质谱(QqQMS/MS)。由于三重四极杆质谱的选择性和灵敏度高，可以对已知化合物进行定量分析，也可以对目标化合物的离子进行的两种不同特征的分析，即相对分子质量和二级碎片特征的分析，减少了杂质干扰，也简化了样品的提取流程，无需耗时和复杂的纯化过程。根据本专利技术的实施例，所述检测处理的流动相为：A：CO2；B：含有0.1mM酸性添加剂的甲醇溶液，优选地，为含有0.1mM酸性添加剂的40％甲醇溶液。根据本专利技术的具体实施例，所述酸性添加剂为选自甲酸铵、甲酸和草酸的至少一种。由此，检测得到的峰形好，无拖尾，使检测结果更准确，并且，浓度为40％甲醇溶液有利于确保超临界条件或至少合理的粘度和扩散系数(亚临界条件)，通过添加草酸，在相应的保留时间内获得了对于其他目标分析物以及鸢尾素和染料木苷的苷元更好的电离。根据本专利技术的实施例，所述检测处理的洗脱梯度为20％B(0-2分钟)-30％B(2-7分钟)-40％B(7-9分钟)-(40-20)％B(9-9.5分钟)-20％B(9.5-12分钟)其中，需要说明的是，在9-9.5分钟，洗脱液中的B组分的浓度由40％逐渐降低至20％。由此，各异黄酮物质的保留时间适宜，各组分峰形尖锐，分离度好。根据本专利技术的实施例，所述超高性能超临界流体色谱-串联质谱的质谱条件：正离子化ESI电离源；MRM模式；二极管阵列检测器；毛细管电压：3kV；锥电压：40V；源温度：100℃；去溶剂化温度本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测异黄酮类化合物的方法，其特征在于，包括：将待测样品利用醇溶液进行提取处理，以便得到提取液；以及利用超高性能超临界流体色谱‑串联质谱对所述提取液进行检测处理，以便获得所述异黄酮类化合物的含量。

【技术特征摘要】
1.一种检测异黄酮类化合物的方法，其特征在于，包括：将待测样品利用醇溶液进行提取处理，以便得到提取液；以及利用超高性能超临界流体色谱-串联质谱对所述提取液进行检测处理，以便获得所述异黄酮类化合物的含量。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述提取处理包括：将所述待测样品用20-40％甲醇溶液萃取24-40分钟，以便得到萃取液；将所述萃取液进行蒸发处理，以便得到蒸发后残渣；以及将所述蒸发后残渣溶于甲醇中，以便得到所述提取液。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述待测样品与所述甲醇溶液按0.1g：20-40ml的比例进行所述萃取。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述超高性能超临界流体色谱-串联质谱中的质谱为三重四极杆质谱。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述检测处理的流动相为：A：CO2；B：含有0.1mM酸性添加剂的甲醇溶液，优选地，为含有0.1mM酸性添加剂的40％甲醇溶液，任选地，所述酸性添加剂为选自甲酸铵、甲酸和草酸的至少一种，任选地，所述检测处理的洗脱梯度为20％B(0-2分钟)-30％B(2-7分钟)-40％B(7-9分钟)-(40-20)％B(9-9.5分钟)-...

【专利技术属性】
技术研发人员：张峰，许秀丽，吴文杰，王秀娟，
申请(专利权)人：中国检验检疫科学研究院，
类型：发明
国别省市：北京,11