一种检测异丙威的试纸条及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种检测异丙威的试纸条及其应用。试纸条包括样品吸收垫(1)、结合物释放垫(2)、反应膜(3)、吸水垫(4)和底板(7)，所述反应膜上具有包被有异丙威半抗原‑载体蛋白偶联物的检测线(5)和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线(6)，所述结合物释放垫(2)喷涂有异丙威单克隆抗体‑胶体金标记物。本发明专利技术还提供了一种应用上述异丙威试纸条检测蔬菜、水果等农作物中异丙威残留的方法。本发明专利技术所提供的试纸条具有操作简单、灵敏度高、检测速度快、成本低等特点，适合大量样本的筛查和现场监控。

【技术实现步骤摘要】
一种检测异丙威的试纸条及其应用
本专利技术涉及一种检测异丙威的试纸条及其应用，具体涉及一种用于检测异丙威的胶体金试纸条，其特别适用于蔬菜、水果等农作物中异丙威残留的检测。
技术介绍
异丙威又名灭扑散、叶婵散，化学名称为邻丙基苯基甲基氨基甲酸酯。该品质1970年由联邦德国Bayer公司推荐用作杀虫剂，具有较强的触杀作用，在防治水稻害虫中发挥了重要作用。近年来，异丙威在蔬菜、水果等农作物中的使用量日益增加，这导致了农作物产品的农药残留量较高，危害人体健康。目前，检测异丙威药物残留的方法多为仪器方法，操作较难，成本较高，本专利技术为快速检测方法，用时短，操作简单，成本较低，适用于基层单位大批量地检测样品。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种灵敏度高、操作简单、成本低、检测时间短的异丙威残留检测试纸条。本专利技术所提供的检测异丙威残留的试纸条，包括样品吸收垫(1)、结合物释放垫(2)、反应膜(3)、吸水垫(4)和底板(7)；所述反应膜上具有包被有异丙威半抗原-载体蛋白偶联物的检测线(5)和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线(6)，所述结合物释放垫(2)喷涂有异丙威单克隆抗体-胶体金标记物。所述异丙威半抗原-载体蛋白偶联物是由异丙威半抗原与载体蛋白偶联得到，所述载体蛋白为牛血清白蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白、甲状腺蛋白、人血清白蛋白。所述异丙威单克隆抗体是以异丙威半抗原-载体蛋白偶联物作为免疫原制备获得，是由异丙威单克隆抗体杂交瘤细胞株分泌获得；所述羊抗鼠抗抗体是将鼠源抗体免疫羊得到。所述样品吸收垫(1)、结合物释放垫(2)、反应膜(3)、吸水垫(4)依次粘贴在底板(7)上，所述结合物释放垫1/3～1/2被覆盖于样品吸收垫下。所述底板可为PVC底板或其他硬质不吸水的材料；所述样品吸收垫可为吸滤纸或滤油纸；所述结合物释放垫可为玻璃棉或聚酯材料；所述吸水垫为吸水纸；所述反应膜可为硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜。本专利技术的另一个目的是提供一种制备上述试纸条的方法，其包括步骤：1)制备喷涂有异丙威单克隆抗体-胶体金标记物的结合物释放垫；2)制备具有包被有异丙威半抗原-载体蛋白偶联物的检测线和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线的反应膜；3)将1)和2)制备好的结合物释放垫、反应膜与样品吸收垫、吸水垫和底板组装成试纸条。具体地说，步骤包括：1)半抗原制备：将4-氨基-2-异丙基苯酚与二碳酸二叔丁酯等物质经过一系列化学反应得到异丙威半抗原；2)将异丙威半抗原与载体蛋白偶联，得到异丙威半抗原-载体蛋白偶联物；3)用异丙威半抗原-载体蛋白偶联物免疫小鼠，将小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞通过融合、筛选，得到异丙威单克隆杂交瘤细胞株；4)提取小鼠IgG免疫健康山羊，得到羊抗鼠抗抗体；5)用柠檬酸三钠与氯金酸反应制备胶体金；6)将步骤3)制备的异丙威单克隆抗体加入步骤5)制备的胶体金中，得到异丙威单克隆抗体-胶体金标记物；7)将异丙威单克隆抗体-胶体金标记物喷涂在结合物释放垫上，37℃烘1h后取出，置于干燥环境中保存备用；8)将异丙威半抗原-载体蛋白偶联物包被在反应膜上构成检测线，将羊抗鼠抗抗体包被在反应膜上构成质控线；9)将样品吸收垫用含0.5％牛血清白蛋白(体积分数)、pH为7.2、0.1mol/L磷酸盐缓冲液浸泡2h，37℃下烘干2h；10)在底板上按顺序粘贴上样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜、吸水垫，样品吸收垫盖住结合物释放垫，最后切成3mm宽的小条，加塑料盒，真空包装，4～30℃条件下可保存12个月。本专利技术的另一个目的是提供一种应用上述试纸条检测蔬菜及农作物中异丙威残留的方法，它包括步骤：(1)样品前处理；(2)用试纸条进行检测；(3)分析检测结果。本专利技术的异丙威快速检测试纸条采用高度特异性的抗体抗原反应及竞争抑制免疫层析分析技术，将异丙威单克隆抗体-胶体金标记物固定于结合物释放垫上，样品中的异丙威在流动过程中，与结合物释放垫上的异丙威单克隆抗体-胶体金标记物结合，形成药物-抗体-胶体金标记物。样本中的药物与反应膜检测线上的异丙威半抗原-载体蛋白偶联物竞争结合异丙威单克隆抗体-胶体金标记物，根据检测线红色条带有无或颜色深浅来判断待测样品液中是否含有异丙威残留。检测时，样品经处理后滴入试纸条孔内，当异丙威在样品中的浓度低于检测限或为零时，单克隆抗体-胶体金标记物在层析过程中会与固定在反应膜上的异丙威半抗原-载体蛋白偶联物结合，在检测线(T)和质控线(C)内各出现一条红色条带；如果异丙威在样品中的浓度等于或高于检测限，单克隆抗体-胶体金标记物会与异丙威全部结合，从而在T线处因为竞争反应不会与异丙威半抗原-载体蛋白偶联物结合而不出现红色条带。本专利技术的试纸条具有灵敏度高、特异性强、成本低、操作简单、检测时间短、适合各种单位使用、储存简单、保质期长的优点。用本专利技术试纸条检测异丙威残留的方法简便、快速、直观、准确、适用范围广、成本低、易推广使用。附图说明图1为异丙威半抗原合成图。图2为试纸条剖面结构示意图。具体实施方式下面结合具体的实施例来进一步阐述本专利技术。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术，而不用来限制本专利技术的范围。实施例1异丙威检测试纸条的制备该试纸条的制备方法主要包括以下步骤：1)制备喷涂有异丙威单克隆抗体-胶体金标记物的结合物释放垫；2)制备具有包被有异丙威半抗原-载体蛋白偶联物的检测线和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线的反应膜；3)将1)和2)制备好的结合物释放垫、反应膜与样品吸收垫、吸水垫和PVC底板组装成试纸条。下面分步详细叙述：1、异丙威半抗原的制备(1)取4-氨基-2-异丙基苯酚1.51g，加二氯甲烷50ml溶解，加二碳酸二叔丁酯2.18g，三乙胺0.4ml，室温搅拌4h，停止反应，旋蒸，除去有机溶剂，加水30ml，乙酸乙酯40ml×3萃取三次，合并有机相，蒸干，二氯甲烷/正己烷(v/v，1/7)90ml重结晶，得到化合物Ⅰ2.3g，收率92％；(2)取化合物Ⅰ2.3g，加无水丙酮60ml溶解，0-5℃，滴加异氰酸甲酯0.73g的，加吡啶1.2ml，充分搅拌后，恢复到室温，继续搅拌3h；旋蒸，除去有机溶剂，上硅胶柱，石油醚/乙酸乙酯(v/v，5/1)洗脱分离，得到化合物Ⅱ2.7g，收率96.43％；(3)取化合物Ⅱ2.7g，加三氟乙酸40ml溶解，室温搅拌6h；停止反应，旋蒸，除去溶剂，加氯仿100ml，溶解澄清，水洗三次，有机相无水硫酸钠干燥，蒸干，乙酸乙酯/正己烷(v/v，1/10)120ml重结晶，得到氨基异丙威半抗原产物1.4g，收率77％。2、免疫原的制备取氨基异丙威半抗原50mg，加1mol/L盐酸，0.48ml，加水5ml，搅拌溶解，澄清，0-5℃搅拌30min，加亚硝酸钠17.2mg，继续搅拌3h，得到活化液A液；取牛血清白蛋白500mg，加0.1mol/L氢氧化钠溶液30ml溶解，0-5℃搅拌30min，得到B液，将全部的A液滴加到B液中，搅拌4h。0.02mol/LPB缓冲液透析三天，每天换液3次，得到异丙威-BSA免疫原，-20℃保存备用。3、包被原的制备取氨基异丙威半抗原30mg，加1mol/L盐酸，0.27ml，加水5ml，搅拌溶解，澄清，0-5℃搅拌30min，加亚硝酸钠13.1mg，继续搅拌3h，得到活化液A液；取卵清蛋白500本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测异丙威的试纸条，包括样品吸收垫(1)、结合物释放垫(2)、反应膜(3)、吸水垫(4)和底板(7)，其特征在于所述反应膜上具有包被有异丙威半抗原‑载体蛋白偶联物的检测线(5)和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线(6)，所述结合物释放垫(2)喷涂有异丙威单克隆抗体‑胶体金标记物，所述异丙威半抗原的制备方法如下：(1)取4‑氨基‑2‑异丙基苯酚1.51g，加二氯甲烷50ml溶解，加二碳酸二叔丁酯2.18g，三乙胺0.4ml，室温搅拌4h，停止反应，旋蒸，除去有机溶剂，加水30ml，乙酸乙酯40ml×3萃取三次，合并有机相，蒸干，二氯甲烷/正己烷(v/v，1/7)90ml重结晶，得到化合物Ⅰ2.3g，收率92％；(2)取化合物Ⅰ2.3g，加无水丙酮60ml溶解，0‑5℃，滴加异氰酸甲酯0.73g的，加吡啶1.2ml，充分搅拌后，恢复到室温，继续搅拌3h；旋蒸，除去有机溶剂，上硅胶柱，石油醚/乙酸乙酯(v/v，5/1)洗脱分离，得到化合物Ⅱ2.7g，收率96.43％；(3)取化合物Ⅱ2.7g，加三氟乙酸40ml溶解，室温搅拌6h；停止反应，旋蒸，除去溶剂，加氯仿100ml，溶解澄清，水洗三次，有机相无水硫酸钠干燥，蒸干，乙酸乙酯/正己烷(v/v，1/10)120ml重结晶，得到氨基异丙威半抗原产物1.4g，收率77％。...

【技术特征摘要】
1.一种检测异丙威的试纸条，包括样品吸收垫(1)、结合物释放垫(2)、反应膜(3)、吸水垫(4)和底板(7)，其特征在于所述反应膜上具有包被有异丙威半抗原-载体蛋白偶联物的检测线(5)和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线(6)，所述结合物释放垫(2)喷涂有异丙威单克隆抗体-胶体金标记物，所述异丙威半抗原的制备方法如下：(1)取4-氨基-2-异丙基苯酚1.51g，加二氯甲烷50ml溶解，加二碳酸二叔丁酯2.18g，三乙胺0.4ml，室温搅拌4h，停止反应，旋蒸，除去有机溶剂，加水30ml，乙酸乙酯40ml×3萃取三次，合并有机相，蒸干，二氯甲烷/正己烷(v/v，1/7)90ml重结晶，得到化合物Ⅰ2.3g，收率92％；(2)取化合物Ⅰ2.3g，加无水丙酮60ml溶解，0-5℃，滴加异氰酸甲酯0.73g的，加吡啶1.2ml，充分搅拌后，恢复到室温，继续搅拌3h；旋蒸，除去有机溶剂，上硅胶柱，石油醚/乙酸乙酯(v/v，5/1)洗脱分离，得到化合物Ⅱ2.7g，收率96.43％；(3)取化合物Ⅱ2.7g，加三氟乙酸40ml溶解，室温搅拌6h；停止反应，旋蒸，除去溶剂，加氯仿100ml，溶解澄清，水洗三次，有机相无水硫酸钠干燥，蒸干，乙酸乙酯/正己烷(v/v，1/10)120ml重结晶，得到氨基异丙威半抗原产物1.4g，收率77％。2.如权利要求1...

【专利技术属性】
技术研发人员：万宇平，吴小胜，王兆芹，何方洋，崔海峰，申梁，丛倩千，彭正学，王立志，吴广，
申请(专利权)人：北京勤邦生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11