一种胰腺导管腺癌标志物及其筛选方法技术

一种胰腺导管腺癌标志物及其筛选方法，属于临床检验诊断领域。针对目前胰腺导管腺癌的诊断标志物检测敏感度及特异性差的问题，本发明专利技术通过高效液相色谱‑串联质谱技术对早期胰腺导管腺癌早期患者血清进行微量代谢组学分析，发现正常人群和早期胰腺导管腺癌人群之间的差异代谢物；进一步通过该技术分析正常人与胰腺导管腺癌患者之间的差异代谢物；找到癌症引起的胰腺导管腺癌患者的特异性差异代谢产物C10:1酰基肉碱和溶血磷脂酰胆碱LysoPC(14:0)，即胰腺导管腺癌的诊断分子。能辅助CA19‑9诊断胰腺导管腺癌人群，能提高CA19‑9阴性患者85％的诊断率。本发明专利技术适用于肿瘤标志物的筛选。

【技术实现步骤摘要】
一种胰腺导管腺癌标志物及其筛选方法
本专利技术属于临床检验诊断领域，具体涉及一种胰腺导管腺癌标志物及其筛选方法。
技术介绍
胰腺导管腺癌是胰腺癌的一种，它是一种恶性程度极高，诊断和治疗都很困难的消化道恶性肿瘤。胰腺导管腺癌早期诊断技术主要包括肿瘤生物标志物、影像学诊断以及基因诊断等方向。但这几种方法仍然存在严重的不足：1)目前腺管上皮的导管腺癌的血清标志物为CA19-9，其用于检测胰腺癌的敏感度与特异性均不高。尤其对于早期胰腺癌的检测，CA19-9的阳性率检出率只有37.5％。2)胆管炎、胰腺炎以及肝炎等良性病变患者的血清中，CA19-9的检测水平也可以显著升高。3)现有的其他胰腺癌肿瘤生物标志物，包括CA50、CA242、CEA、AFP等，其诊断效能并不比CA19-9更好。
技术实现思路
针对目前胰腺导管腺癌的诊断标志物检测敏感度及特异性差的问题，本专利技术通过高效液相色谱-串联质谱技术对早期胰腺导管腺癌早期患者血清进行微量代谢组学分析，发现正常人群和早期胰腺导管腺癌人群之间的差异代谢物；进一步通过该技术分析正常人与胰腺导管腺癌患者之间的差异代谢物；找到癌症引起的胰腺导管腺癌患者的特异性差异代谢产物，即胰腺导管腺癌的诊断分子。本专利技术的目的在于提供了一种基于代谢组学的胰腺导管腺癌诊断标志物。本专利技术所述的胰腺导管腺癌标志物，为C10:1酰基肉碱和溶血磷脂酰胆碱LysoPC(14:0)中的一种或两种的组合。进一步地限定，当所述胰腺导管腺癌标志物为C10:1酰基肉碱和溶血磷脂酰胆碱LysoPC(14:0)的组合物时，两标志物的拟合得分为y＝-8.13e-6*x1-1.875e-5*x2，其中x1为C10:1酰基肉碱质谱检测响应值，x2为溶血磷脂酰胆碱LysoPC(14:0)质谱检测响应值，y为两个潜在生物标志物拟合后得分。上述胰腺导管腺癌标志物的筛选方法，包括如下步骤：1)取胰腺导管腺癌病人临床血清样本N1例和健康人对照M1例作为训练集；取胰腺导管腺癌患者N2例和健康人对照M2例作为验证集，其中，N1≥185，M1≥146，N2≥50，M2≥50；2)每例血清样本分别加入样本3倍体积的甲醇-乙腈混合溶液，得到的混合溶液在冰水浴中静置后，离心，取上清；3)通过色谱-质谱联用代谢组学分析方法对上述样品进行质谱分析；4)然后筛选差异代谢物，获得胰腺导管腺癌标志物。进一步地限定，步骤2)所述甲醇-乙腈混合溶液中甲醇与乙腈体积比为1：1。进一步地限定，步骤2)所述得到的混合溶液经斡旋1min后，在冰水浴静置15min，然后在4℃下，12000g高速离心15min。进一步地限定，步骤3)所述色谱-质谱联用代谢组学分析方法中色谱分离所用的色谱柱为BEHC18色谱柱。进一步地限定，步骤3)所述色谱-质谱联用代谢组学分析方法中色谱分离所采用的流动相A为含有体积分数0.1％甲酸的水，流动相B为含有体积分数0.1％甲酸的乙腈。进一步地限定，所述色谱-质谱联用代谢组学分析方法中色谱分离所采用的分离时间为15分钟，流速为0.3mL/min；其色谱梯度为：0到0.5分钟，流动相A从0到1％且流动相B从100％到99％；0.5到3.5分钟，流动相A从1％到53％且流动相B从99％到47％；3.5到7.5分钟，流动相A从53％到70％且流动相B从47％到30％；7.5到9分钟，流动相A从70％到90％且流动相B从30％到10％；9到13分钟，流动相A保持90％且流动相B保持10％；13.1到15分钟，流动相A梯度返回1％。进一步地限定，步骤3)所述色谱-质谱联用代谢组学分析方法中质谱分析采用正负离子扫描模式，其中正离子模式电压为4kV，负离子模式电压3.5kV；雾化温度：330℃；雾化流速：10L/min；碎裂电压：100V；筛选电压：65V；扫描范围：70-1100m/z；扫描速度：1.5谱/sec。进一步地限定，步骤4)所述差异代谢物的筛选方法包括血清代谢组学轮廓分析、数据的前处理及多元统计分析，筛选的标准为：1)以性别、年龄为交互因素的Logistics模型中，这些因素能否对差异性代谢产物的预测性能造成显著性影响；2)差异性代谢产物与CA19-9的Pearson相关系数小于0.15；3)在受试者工作曲线分析中，差异性代谢产物的曲线下面积大于0.8，同时满足以上3个标准的差异代谢产物作为胰腺导管腺癌标志物。本专利技术所述的胰腺导管腺癌可用于制备胰腺导管腺癌诊断试剂盒。有益效果本专利技术公开了基于代谢组学的胰腺导管腺癌早期诊断标志物，所述诊断标志物由以下化合物组成：C10:1酰基肉碱和溶血磷脂酰胆碱LysoPC(14:0)。本专利技术还公开了基于代谢组学的胰腺导管腺癌早期诊断标志物的筛选方法。本专利技术通过高效液相色谱-串联质谱技术对患者血清进行微量代谢组学分析，通过该技术分析正常人与胰腺导管腺癌患者血清代谢轮廓的差异；进一步发现正常人群和胰腺导管腺癌人群之间的差异代谢物；找到胰腺导管腺癌患者的特异性差异代谢产物，即胰腺导管腺癌的诊断分子；本专利技术获得的胰腺导管腺癌标志物能辅助CA19-9诊断胰腺导管腺癌人群，能提高CA19-9阴性患者85％的诊断率。本专利技术所提供的方法具有无创，方便快捷的特点，并且能够准确反应患者与正常对照组的代谢图谱差异，特异性高。本专利技术为患者争取时间，尽早开始治疗，提高临床治疗效果。附图说明图1为正，负离子模式下两组总离子流图(BPCs)图。A)正离子模式下正常对照组BPC图；B)正离子模式下胰腺导管腺癌组BPC图；C)负离子模式下正常对照组BPC图；D)负离子模式下胰腺导管腺癌组BPC图,各图中横坐标为保留时间min，纵坐标为相对相应强度。图2为正常对照组和胰腺导管腺癌组总离子主成分分析和偏最小二乘判别分析的得分图。A)总离子主成分分析(PCA)得分图；B)总离子代谢轮廓偏最小二乘判别分析(PLS-DA)得分图；C)PLS-DA在100次置换测试交叉验证图。图3为生物标志物的评估。A)LysoPC(14:0)训练集下的ROC曲线；B)C10:1酰基肉碱训练集下的ROC曲线；C)LysoPC(14:0)验证集下的ROC曲线；D)C10:1酰基肉碱验证集下的ROC曲线，各图中横坐标为1-特异度，纵坐标为灵敏度。图4为生物标志物分数的图形表示的散点图。每一个点均为一个患者，被圈出的个体为CA19-9不敏感且潜在标志物敏感患者，横坐标为CA19-9含量，其中CA19-9含量临界点为37U/mL,纵坐标为拟合后得分,其中联合诊断后两个生物标志物的临界点(阈值)为0.541。具体实施方式收集胰腺导管腺癌病人及健康人的血清样本，其中胰腺导管腺癌患者235例和健康人对照196例。样本经处理后通过超高效液相色谱-质谱联用仪检测分析，通过建立多维统计模型可视化地显示胰腺导管腺癌病人及健康人对照之间的代谢谱差异，通过统计学方法获得差异性代谢物。本专利技术的测定方法可以全面、综合地体现胰腺导管腺癌病人及健康人之间的代谢产物的变异状况，找到胰腺导管腺癌的诊断标记物，为胰腺导管腺癌的早期诊断和预后提供有利的技术支持。下述实施例中所述超高效液相色谱仪购买自沃特世公司，电喷雾离子化-四级杆/飞行时间串联质谱仪购买自安捷伦公司。所述训练集是指：用于构建模型样本的集合本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种胰腺导管腺癌标志物，其特征在于，为C10:1酰基肉碱和溶血磷脂酰胆碱LysoPC(14:0)中的一种或两种的组合。

【技术特征摘要】
1.一种胰腺导管腺癌标志物，其特征在于，为C10:1酰基肉碱和溶血磷脂酰胆碱LysoPC(14:0)中的一种或两种的组合。2.根据权利要求1所述的一种胰腺导管腺癌标志物，其特征在于，当所述胰腺导管腺癌标志物为C10:1酰基肉碱和溶血磷脂酰胆碱LysoPC(14:0)的组合物时，两标志物的拟合得分为y＝-8.13e-6*x1-1.875e-5*x2,其中x1为C10:1酰基肉碱质谱检测响应值，x2为溶血磷脂酰胆碱LysoPC(14:0)质谱检测响应值，y为两个潜在生物标志物拟合后得分。3.权利要求1或2所述的胰腺导管腺癌标志物的筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：1)取胰腺导管腺癌病人临床血清样本N1例和健康人对照M1例作为训练集；取胰腺导管腺癌患者N2例和健康人对照M2例作为验证集，其中，N1≥185，M1≥146，N2≥50，M2≥50；2)每例血清样本分别加入样本3倍体积的甲醇-乙腈混合溶液，得到的混合溶液在冰水浴中静置后，离心，取上清；3)通过色谱-质谱联用代谢组学分析方法对上述样品进行质谱分析；4)然后筛选差异代谢物，获得胰腺导管腺癌标志物。4.根据权利要求3所述的胰腺导管腺癌标志物的筛选方法，其特征在于，步骤2)所述甲醇-乙腈混合溶液中甲醇与乙腈体积比为1：1。5.根据权利要求3所述的胰腺导管腺癌标志物的筛选方法，其特征在于，步骤2)所述得到的混合溶液经斡旋1min后，在冰水浴静置15min，然后在4℃下，12000g高速离心15min。6.根据权利要求3所述的胰腺导管腺癌标志物的筛选方法，其特征在于，步骤3)所述色谱-质谱联用代谢组学分析方法中色谱分离所采用的流动相A为含有体积分数0.1％甲酸的水，流动相B为...

【专利技术属性】
技术研发人员：聂桓，李钰，张笑含，陆欣，史秀云，
申请(专利权)人：哈尔滨工业大学，
类型：发明
国别省市：黑龙江,23