一种检测miR5100、CXCL-12和IL-8相对表达量的方法技术

本发明专利技术提出了一种检测miR5100、CXCL‑12和IL‑8相对表达量的方法，运用qPCR技术，对miR5100，CXCL‑12和IL‑8多个指标的相对表达量进行检测；本发明专利技术提出的方法只需要用血液作为样本，整个检测过程成本更低；本发明专利技术提出的方法相对于传统方法更方便，出结果更快；相对于已经公开的方法，其结果更可信。

【技术实现步骤摘要】
一种检测miR5100、CXCL-12和IL-8相对表达量的方法
本专利技术涉及生物
，具体涉及一种检测miR5100、CXCL-12和IL-8相对表达量的方法。
技术介绍
MiRNA是一种非编码的单链RNA，长度大约为18-25个核苷酸。它可以结合靶基因mRNA的3’UTR上，引起mRNA降解或者抑制其翻译，从而调控靶基因的表达，参与细胞增殖、分化、凋亡等一系列重要的生物学进程，实现转录后水平的调控。趋化因子CXCL-12又称基质细胞衍生因子-1(SDF-1)是小分子的细胞因子，是一个定位于10号染色体由基质细胞产生的CXC类趋化因子，属于趋化蛋白家族，趋化因子CXCL-12对淋巴细胞有着强烈的趋化作用并在发育中起重要作用，目前认为CXCR-4和CXCR-7是CXCL-12的两个受体。白细胞介素-8(IL-8)，又称为趋化因子CXCL-8，是巨噬细胞和上皮细胞等分泌的细胞因子，IL-8是一种最主要的中性粒细胞激活趋化因子，可以促进中性粒细胞及淋巴细胞的渗出和聚集，并作用于不同的细胞，促进炎性反应进程、刺激血管的形成、促进有丝分裂、调节宿主免疫功能等。现有的miR5100、CXCL-12和IL-8的检测方法都是基于纯化的RNA为模板，由于提取核酸中RNA沉淀和回收的不完全，将会不可避免的造成一些RNA丢失。此外，RNA提取过程中，易造成污染和浪费。可见，现有技术还有待完善。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术应用qPCR技术，通过对miR5100、CXCL-12和IL-8多个指标的相对表达量进行检测，相对于传统方法更方便，出结果更较快；相对于已经公开的方法，其结果更可信。本专利技术的技术方案是这样实现的：本专利技术提供了一种检测miR5100、CXCL-12和IL-8相对表达量的方法，所述方法包括：样品中总RNA的提取、RNA反转录反应和实时荧光定量PCR。在以上技术方案的基础上，优选的，所述样品中总RNA的提取，使用试剂盒为RNAisoPlus，包括以下步骤：(1)抽取受试者血液4ml，4℃放置备用；(2)向200ul全血中加入1mlRNAisoPlus，冰上裂解10min；(3)加入200ul的氯仿，混合均匀，冰上静置5min；(4)4℃12000g/min离心10min，收取上清液于无RNA酶的1.5ml离心管；(5)向离心管中加入与上清液等体积的异丙醇，混匀，冰上静置10min；(6)4℃12000g/min离心10min，弃上清液；(7)加入1ml用DEPC水稀释的75％乙醇，7500g/min离心2min；(8)弃上清液，干燥5min；(9)加20ulDEPC水室温溶解；(10)使用Nanodrop2000测定RNA浓度，保留OD260/OD280值在1.8-2.0之间的样品。在以上技术方案的基础上，优选的，所述RNA反转录反应，使用试剂盒为PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser，包括如下步骤：(1)基因组DNA的去除反应在微量管里加入5xgDNAEraserBuffer2.0ul、gDNAEraser1.0ul、TotalRNA1.0ug、RNaseFreedH2O补足到10ul，42℃去除基因组DNA反应2min；(2)反转录反应反应体系为20ul：向步骤1的微量管里分别加入RNaseFreedH2O4ul、5xPrimeScriptBuffer(forRealTime)4.0ul、混合后再加入RTPrimerMix1.0ul、PrimeScriptRTEnzymeMixI1.0ul轻轻混匀。具体的，反应条件为：37℃逆转录15min、85℃变性5s、4℃冷藏保存，其中，合成的cDNA需要在-20℃保存。在以上技术方案的基础上，优选的，所述RNA反转录反应条件为：37℃逆转录反应时间为30min。在以上技术方案的基础上，优选的，所述实时荧光定量PCR，包括对miR5100进行实时荧光定量PCR、对CXCL-12进行实时荧光定量PCR和对IL-8进行实时荧光定量PCR。进一步优选的，所述对miR5100进行实时荧光定量PCR，所使用试剂盒为HieffqPCRSYBRGreenMasterMix(NoRox)，包括如下步骤：(1)20ulqPCR反应体系：2XSYBRGreenMix10ul、cDNA2ul、U6上游引物0.8ul、U6下游引物0.8ul、ddH2O补足20ul；(2)qPCR反应条件为：95℃预变性5min、95℃变性10s、60℃退火20s、72℃延伸20s，共40个循环；溶解曲线95℃变性15s、60℃复性60s、95℃变性15s，U6做为miR5100内参。进一步优选的，所述对CXCL-12进行实时荧光定量PCR，所使用试剂盒为HieffqPCRSYBRGreenMasterMix(NoRox)，包括如下步骤：(1)20ulqPCR反应体系：2XSYBRGreenMix10ul、cDNA2ul、GAPDH上游引物0.8ul、GAPDH下游引物0.8ul、ddH2O补足20ul；(2)qPCR反应条件为：95℃预变性5min、95℃变性10s、60℃退火20s、72℃延伸20s，共40个循环。溶解曲线95℃变性15s、60℃复性60s、95℃变性15s。GAPDH做为CXCL-12内参。进一步优选的，所述对IL-8进行实时荧光定量PCR，所使用试剂盒为HieffqPCRSYBRGreenMasterMix(NoRox)，包括如下步骤：(1)20ulqPCR反应体系：2XSYBRGreenMix10ul、cDNA2ul、GAPDH上游引物0.8ul、GAPDH下游引物0.8ul、ddH2O补足20ul；(2)qPCR反应条件为：95℃预变性5min、95℃变性10s、60℃退火20s、72℃延伸20s，共40个循环。溶解曲线95℃变性15s、60℃复性60s、95℃变性15s。GAPDH作为IL-8的内参。本专利技术的一种检测miR5100、CXCL-12和IL-8相对表达量的方法相对于现有技术具有以下有益效果：(1)本专利技术通过对miR5100，CXCL-12和下游靶基因IL-8多个指标的相对表达量进行检测，相对于传统方法更方便，出结果更快；相对于已经公开的方法，其结果更可信；(2)本专利技术的一种检测miR5100、CXCL-12和IL-8相对表达量的方法，只需要血液作为样本，整个检测过程成本低，速度快、操作简便。具体实施方式下面将结合本专利技术实施方式，对本专利技术实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式仅仅是本专利技术一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本专利技术中的实施方式，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本专利技术保护的范围。实施例一本实施例提供了一种提取样品中总RNA的方法，所用试剂盒为RNAisoPlus，具体步骤如下：(1)抽取受试者血液4ml，4℃放置备用；(2)向200ul全血中加入1mlRNAisoPlus，冰上裂解10min；(3)加入200ul的1/5的氯仿，缓慢颠倒，冰上静置5min；(4)4℃12000g/min离心10min，收取上清液无RNA酶的1.5ml本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测miR5100、CXCL‑12和IL‑8相对表达量的方法，其特征在于：所述方法包括：样品中总RNA的提取、RNA反转录反应和实时荧光定量PCR。

【技术特征摘要】
1.一种检测miR5100、CXCL-12和IL-8相对表达量的方法，其特征在于：所述方法包括：样品中总RNA的提取、RNA反转录反应和实时荧光定量PCR。2.如权利要求书1所述的一种检测miR5100、CXCL-12和IL-8相对表达量的方法，其特征在于：所述样品中总RNA的提取，使用试剂盒为RNAisoPlus，包括以下步骤：(1)抽取受试者血液4ml，4℃放置备用；(2)向200ul全血中加入1mlRNAisoPlus，冰上裂解10min；(3)加入200ul的氯仿，混合均匀，冰上静置5min；(4)4℃12000g/min离心10min，收取上清液于无RNA酶的1.5ml离心管；(5)向离心管中加入与上清液等体积的异丙醇，混匀，冰上静置10min；(6)4℃12000g/min离心10min，弃上清液；(7)加入1ml用DEPC水稀释的75％乙醇，7500g/min离心2min；(8)弃上清液，干燥5min；(9)加20ulDEPC水，溶解；(10)使用Nanodrop2000测定RNA浓度，保留OD260/OD280值在1.8-2.0之间的样品。3.如权利要求1所述的一种检测miR5100、CXCL-12和IL-8相对表达量的方法，其特征在于：所述RNA反转录反应，使用试剂盒为PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser，包括以下步骤：(1)基因组DNA的去除反应：在微量管里加入5xgDNAEraserBuffer2.0ul、gDNAEraser1.0ul、TotalRNA1.0ug和RNaseFreedH2O补足到10ul，42℃去除基因组DNA反应2min；(2)反转录反应：向步骤(1)的微量管里分别加入RNaseFreedH2O4ul、5xPrimeScriptBuffer(forRealTime)4.0ul混合后再加入RTPrimerMix1.0ul和PrimeScriptRTEnzymeMixI1.0ul轻轻混匀；反应条件为：37℃逆转录15min、85℃变性5s，4℃冷藏保存。4.如权利要求3所述的一种检测miR5100、CXCL-12和IL-8相对表达量的方法，其特征在于：所述RNA反转录反应条件为37℃逆转录30min。5.如权利要求1所述的一种检测miR5100、C...

【专利技术属性】
技术研发人员：廖兴华，张慧敏，项园，黄凤，戴周彤，张子健，李含含，范丽娟，姚奥，李佳蓬，李慧，杜庆，张同存，
申请(专利权)人：武汉科技大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42