利用实时荧光定量PCR技术检测动物制品中转基因三文鱼外源基因成分的检测方法技术

本发明专利技术公开了一种利用实时荧光定量PCR技术检测动物制品中转基因三文鱼外源基因成分的检测方法，包括以下步骤：第一步，以待测样品的DNA为模板，进行荧光定量PCR扩增，获得PCR扩增产物；第二步，检测扩增产物的荧光信号；第三步，以检测结果的Ct值判定样品中是否含有转基因三文鱼外源基因成分；其中，用于PCR扩增的反应体系中含有扩增转基因三文鱼外源基因成分的特异性引物对和转基因三文鱼外源基因成分的特异性探针。本发明专利技术的转基因三文鱼外源基因成分的特异性引物对和探针不仅特异性好，而且灵敏度高，为快速准确地检测动物制品中是否含有转基因三文鱼外源基因成分提供了一种定量检测方法，具有较好的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
利用实时荧光定量PCR技术检测动物制品中转基因三文鱼外源基因成分的检测方法
本专利技术属于生物工程领域，具体地说，是关于一种利用实时荧光定量PCR技术检测动物制品中转基因三文鱼外源基因成分的检测方法。
技术介绍
2015年11月19日，在确认其食用安全和环境安全性之后，美国食物药品管理局(FDA)批准了水恩公司(AquaBounty)的转基因三文鱼品系“AquAdvantage”上市，从而使之成为首个获批的供食用转基因动物。这种三文鱼的主要特点是生长迅速，相比常规三文鱼(大西洋鲑，Salmosalar)节省一年半的养殖时间，从而大大降低了成本。这种三文鱼采取了纯陆基培养方式，鱼卵在加拿大培育而养殖和屠宰则在巴拿马进行，鱼肉运回美国，作为“大西洋三文鱼”出售。由于含有转基因成分的AuqAdvantage三文鱼与传统三文鱼并无差异，在出售时只会标注为“养殖”和“产自巴拿马”，不会有其他标注。所以对于普通消费者来说根本无法区分。目前，中国三文鱼消费已进入快车道，到2018年我国三文鱼市场需求规模将接近90亿元，市场需求空前巨大，而我国目前尚未批准转基因三文鱼食用。这巨大的市场需求、价格差异和相关检测技术缺失必将产生严重的生物安全漏洞。如何进行生物监测将是一个重大挑战。因此精确、快速、高灵敏度的转基因三文鱼外源基因检测方法的建立工作具有非常重要的意义。常见的动物制品真伪鉴别技术主要包括：(1)基于蛋白质分子结构的免疫分析技术等；基于蛋白大分子结构的免疫分析方法具有高灵敏度、高通量、操作简便的特点，可实现对大量样品的快速检测。例如，Macedo-Silva等通过制备抗牛、鸡、猪、马白蛋白的抗血清建立了ELISA方法用于鉴别汉堡中可能掺入的廉价肉类成分，灵敏度可达0.6％。但是，基于抗原-抗体特异性结合的免疫分析方法对于亲缘关系较近的物种易出现交叉反应。蛋白质三级结构在食物加工过程中可能受到破坏而影响抗体识别也是该方法的重要不足之处。(2)基于核酸的分子生物学技术，如PCR、实时荧光PCR和分子指纹技术等；基于DNA序列特异性的分子生物学技术以动物种属间遗传信息的差异作为物种鉴别的检测靶点而被广泛使用。相比于蛋白质，DNA由于热稳定性高，在加工过程中虽然存在一定程度的降解，但仍能提取出小片段DNA用于PCR等分析。同时DNA具有特异性高、灵敏度高、不受组织类别限制等诸多优势，对于亲缘关系较近的物种具有较高的分辨能力。近年来，基于DNA检测技术的肉及肉制品真实性鉴别方法的研究越来越多。目前主要集中于以PCR为基础的各类分析方法，其中包括DNA测序、多重PCR、实时荧光定量PCR等。特别是实时荧光定量PCR技术在动物源性成分的检测领域，日渐成为主流检测技术。
技术实现思路
本专利技术通过研究发现：检测某一个物种纯肉样品中的动物源性成分，利用外源基因设计的引物和探针进行检测，其Ct值为18-24；当样品中目标成分在0.001％时，Ct值在37左右。为此本专利技术利用外源基因进行物种鉴别检测，结果发现利用外源基因检测可避免出现假阳性结果或很难判断结果的情况发生，并且利用外源基因进行检测，所以寻找合适的外源基因进行检测并据此建立标准方法显得非常必要。本专利技术的首要目的在于提供一种动物制品中转基因三文鱼外源基因成分的实时荧光PCR检测方法，以克服现有技术所存在的检测空白。本专利技术的第二个目的在于提供一种检测试剂盒以及检测试剂盒的应用。本专利技术的第三个目的在于提供一种动物制品中转基因三文鱼外源基因成分的实时荧光PCR检测方法的引物对和探针。为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：作为本专利技术的第一个方面，一种利用实时荧光定量PCR技术检测动物制品中转基因三文鱼外源基因成分的检测方法，该方法包括以下步骤：第一步，以待测样品的DNA为模板，进行荧光定量PCR扩增，获得PCR扩增产物；第二步，检测扩增产物的荧光信号；第三步，以检测结果的Ct值判定样品中是否含有转基因三文鱼外源基因成分；其中，用于PCR扩增的反应体系中含有扩增转基因三文鱼外源基因成分的特异性引物对和转基因三文鱼外源基因成分的特异性探针，所述扩增转基因三文鱼外源基因成分的特异性引物对的序列如SEQIDNO：2和SEQIDNO：3所示，所述转基因三文鱼外源基因成分的特异性探针的序列如SEQIDNO：4所示。根据本专利技术，所述PCR扩增的条件如下：反应体系为25μL：2XTaqManMastermix12.5μL，引物各10μM，探针5μM，DNA模板5μL；PCR反应条件：95℃10min；95℃15s；60℃1min；共45个循环。作为本专利技术的第二个方面，一种转基因三文鱼外源基因成分的检测试剂盒，该检测试剂盒含有以下试剂：(a)扩增转基因三文鱼外源基因成分的特异性引物对；(b)转基因三文鱼外源基因成分的特异性探针；其中，所述扩增转基因三文鱼外源基因成分的特异性引物对的序列如SEQIDNO：2和SEQIDNO：3所示，所述转基因三文鱼外源基因成分的特异性探针的序列如SEQIDNO：4所示。进一步的，所述检测试剂盒还包括：(c)标准参照物，用于定性检测样品中的转基因三文鱼外源基因的成分。作为本专利技术的第三个方面，一种上述所述的检测试剂盒的应用，所述检测试剂盒用于定性检测动物制品中的转基因三文鱼外源基因成分。作为本专利技术的第四个方面，一种转基因三文鱼外源基因成分的特异性引物对和探针，所述特异性引物对的序列如SEQIDNO：2和SEQIDNO：3所示，所述特异性探针的序列如SEQIDNO：4所示。本专利技术的有益效果是：1、提供了一种可以特异性检测转基因三文鱼外源基因成分的引物对和探针，其特异性良好，对于转基因三文鱼外源基因成分能够实现特异性扩增，而对于转基因三文鱼外源基因以外的其它成分则不能特异性扩增；而且，所述引物对和探针具有良好的再现性、结果稳定可靠。2、利用所述的引物对和探针可快速、大批量地检测动物制品中是否存在转基因三文鱼外源基因成分，并且所需样品量少，操作简单，灵敏度高。3、本专利技术的转基因三文鱼外源基因成分的实时荧光PCR检测方法，其适用范围广，特别适用于各类动物制品中的转基因三文鱼外源基因成分的检测，因此可以推广应用，对保障产品的质量，保护消费者知情权和选择权，维护正常的经济秩序等提供了技术支持，为食品的市场监督部门和海关部门提供了技术支持。附图说明图1为实施例1的第一组引物对和探针的实时荧光PCR灵敏度试验扩增曲线图。其中，扩增曲线从左到右分别是1ng/μL，0.1ng/μL，0.01ng/μL，0.001ng/μL，0.0001ng/μL，转基因三文鱼外源基因DNA样品。图2为实施例1的第二组引物对和探针的实时荧光PCR灵敏度试验扩增曲线图。其中，扩增曲线从左到右分别是1ng/μL，0.1ng/μL，0.01ng/μL，0.001ng/μL，0.0001ng/μL转基因三文鱼外源基因DNA样品。图3为实施例1的第一组引物对和探针的实时荧光PCR引物特异性试验的扩增曲线图。其中，扩增曲线为转基因三文鱼外源基因DNA样品。具体实施方式以下结合具体实施例，对本专利技术作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本专利技术而非用于限定本专利技术的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用实时荧光定量PCR技术检测动物制品中转基因三文鱼外源基因成分的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：第一步，以待测样品的DNA为模板，进行荧光定量PCR扩增，获得PCR扩增产物；第二步，检测扩增产物的荧光信号；第三步，以检测结果的Ct值判定样品中是否含有转基因三文鱼外源基因成分；其中，用于PCR扩增的反应体系中含有扩增转基因三文鱼外源基因成分的特异性引物对和转基因三文鱼外源基因成分的特异性探针，所述扩增转基因三文鱼外源基因成分的特异性引物对的序列如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示，所述转基因三文鱼外源基因成分的特异性探针的序列如SEQ ID NO：4所示。

【技术特征摘要】
1.一种利用实时荧光定量PCR技术检测动物制品中转基因三文鱼外源基因成分的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：第一步，以待测样品的DNA为模板，进行荧光定量PCR扩增，获得PCR扩增产物；第二步，检测扩增产物的荧光信号；第三步，以检测结果的Ct值判定样品中是否含有转基因三文鱼外源基因成分；其中，用于PCR扩增的反应体系中含有扩增转基因三文鱼外源基因成分的特异性引物对和转基因三文鱼外源基因成分的特异性探针，所述扩增转基因三文鱼外源基因成分的特异性引物对的序列如SEQIDNO：2和SEQIDNO：3所示，所述转基因三文鱼外源基因成分的特异性探针的序列如SEQIDNO：4所示。2.如权利要求1所述的利用实时荧光定量PCR技术检测动物制品中转基因三文鱼外源基因成分的检测方法，其特征在于，所述PCR扩增的条件如下：反应体系为25μL：2XTaqManMastermix12.5μL，引物各10μM，探针5μM，DNA模板5μL；...

【专利技术属性】
技术研发人员：蔡一村，王强，林颖峥，吕蓉，潘良文，
申请(专利权)人：上海出入境检验检疫局动植物与食品检验检疫技术中心，
类型：发明
国别省市：上海,31