一种乳酸菌菌种长期保藏方法技术

本发明专利技术公开了一种乳酸菌菌种长期保藏方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)配制γ‑聚谷氨酸溶液与甘油混合，制成γ‑聚谷氨酸‑甘油混合溶液；(2)制作棉球，灭菌备用；(3)制备乳酸菌菌种液；(4)将步骤(2)制作的棉球浸入步骤(3)的乳酸菌种液中，将吸附有菌液的棉球置于离心管中，再用无菌注射器注入步骤(1)中配制的γ‑聚谷氨酸‑甘油混合液至装满离心管，得到待保藏样品；(5)将步骤(4)得到的待保藏样品低温保藏。使用该方法进行乳酸菌的保藏，可以将保藏年限延长至10‑15年，乳酸菌的存活率可高达90％以上，保藏后的菌种恢复活性应用方便，恢复后菌种活性与原始菌种几乎相同。

【技术实现步骤摘要】
一种乳酸菌菌种长期保藏方法
本专利技术涉及微生物菌种保藏领域，具体涉及一种乳酸菌菌种长期保藏方法。
技术介绍
微生物菌种的保藏是从事微生物研究工作遇到的一个重要问题，现有的一些菌种保藏方法，在菌种保藏过程中往往需要经常地活化传代，菌种保藏工作复杂而繁琐，且常常因保藏不当造成菌种丢失，给工作带来极大的不便。保藏菌种的原理主要是依据微生物的生理代谢特点，创造一种外部条件，使微生物细胞代谢处于停滞、不活跃、生长繁殖受抑制的休眠状态，但细胞并不死亡，遇到适宜的条件又可马上复活。通常采用低温冷冻、干燥缺氧、营养缺乏等方法，或几种方法并行使用，使菌种暂时处于休眠状态。理想的保藏方法除了长期保持菌种原有的优良性状不变外，保藏方法本身的简便易操作也非常重要，同时还要考虑保藏成本的经济性，以便能使保藏方法被广泛使用。菌种是从事微生物学研究及发酵工业生产的基本材料，也是国家的重要资源。菌种保藏就是采用最合适的保存方法，使菌种的变异和死亡减少到最低限度的一项经常性工作。目前，微生物菌种的保藏方法主要有以下几种：①定期移植法：就是将菌种接种于适宜的培养基中，在最适条件下培养，待生长到一定阶段后，于4～6℃进行保存并间隔一定时间进行移植培养。此法操作简单，但保存时间短，需要经常移种，易于变异，只能作为菌种的短期保藏。②液体石蜡保藏法：该方法是首先将优质化学纯液体石蜡进行灭菌，然后把灭菌后的液体石蜡注入已长好菌的斜面上，使菌种与空气隔绝。试管直立置于冰箱(4～6℃)低温保存。保藏期间应定期检查，如培养基露出液面，应及时补充无菌的液体石蜡。此方法主要用于丝状真菌、酵母、细菌和放线菌的保藏，保藏期1-2年。缺点是必须直立存放，占空间大，不便携带，并且某些以石蜡为碳源，或对液体石蜡保藏敏感的菌株都不能用此法保藏。③沙土管保藏法：该方法为取60～80目河沙和非耕作层贫瘠且粘性较小的土，用吸铁石吸去铁质，用10％盐酸浸泡24h后弃盐酸，分别用水洗至中性，将沙土烘干备用。将处理后的沙、土按质量比2∶1混合。混匀的沙土分装入安瓿管或小试管中，塞好棉塞，灭菌备用。把制备好的菌悬液分装每支沙土管0.5mL，放线菌和霉菌可直接挑取孢子拌入沙土管中。塞好棉塞放入盛有干燥剂的容器中，用真空泵抽去水分。存放于低温(4～6℃)干燥处保藏，每隔半年验证1次。本法方法简便，设备简单，适用于产孢子和有芽孢的菌种保藏，可保存2年,但对营养细胞不适用。④真空冷冻干燥保藏法：该方法分为好氧菌冷冻干燥保藏和厌氧菌冷冻干燥保藏。此方法是国际菌种保藏机构通常采用的方法之一，应用最为广泛，几乎所有的微生物均可采用此法保藏。适用于菌种长期保存，一般可保存数年至十余年。方便之处在于因冷冻干燥管无需低温保藏，所以运输方便，但此法所需设备要求高，操作复杂，费用昂贵，且恢复应用时不方便。⑤冷冻保藏法：此法存活率高，稳定性强，保藏时间长，是长期保藏菌种的较好方法。适用于各种菌种的保藏，特别适用于难以用真空干燥保藏等方法保藏的菌种。但此法需定期向液氮罐中补充液氮，以保证液氮罐中的温度，要求条件高，操作复杂，保藏成本较高，且恢复应用时不方便。中国专利申请2005100903112公开了一种食用菌液体菌种的保存方法，该专利技术所提供的食用菌液体菌种的保存方法，是将食用菌液体菌种先经过快速冷冻降温到-40℃～-20℃后，再在-40℃～-20℃温度下进行保藏，其温度下降速率为1-6℃/min。本专利技术利用-40℃～-20℃的低温保存菌种，经冷冻保存的液体菌种经解冻活化，接种固体培养基后能正常萌发，可用于生产食用菌。本专利技术的食用菌液体菌种的低温保存方法简便易行，采用冷藏冰柜即可满足要求，成本低、效益高，对菌种的前期培养条件没有附加要求，凡是以液体培养方式得到的食用菌菌种均可以用本专利技术的方法保存，在实际生产中容易推广使用，但还是该保存方法只适用于食用菌液体菌种，应用范围具有局限性。针对现有技术中的缺陷与不足，开发一种操作简便，成本低廉，保藏期长的菌种保藏方法尤为重要。
技术实现思路
基于上述现有技术中存在的问题，本专利技术旨在提供一种操作简便，成本低廉，保藏期长可达10-15年的菌种保存方法。本专利技术公开的保存方法不仅适用于乳酸菌，还适宜于厌氧细菌、好氧细菌、霉菌、酵母和放线菌等各类微生物的保藏，应用范围非常广泛，本专利技术公开的保存方法的另一突出的特点是菌种可以快速恢复应用。为了实现上述目的，本专利技术采用的技术方案如下：一种乳酸菌菌种简便长期保藏方法，包括以下步骤：(1)首先配制γ-聚谷氨酸甘油混合溶液，灭菌后备用；(2)制作棉球，并将其置于玻璃培养皿中，并在玻璃培养皿外包裹铝箔纸或牛皮纸，灭菌后备用；(3)培养待保藏的乳酸菌菌种，得到乳酸菌菌种液；(4)用无菌镊子夹取步骤(2)中制备的无菌棉球浸入步骤(3)培养好的乳酸菌菌种液中，使棉球吸附充足，然后将吸附有菌液的棉球置于离心管中，用无菌注射器注入步骤(1)中配制的γ-聚谷氨酸甘油混合液，得到待保藏样品；(5)将步骤(4)得到的待保藏样品低温保藏。具体的，上述保藏方法包括以下步骤：(1)首先配制γ-聚谷氨酸溶液，然后取γ-聚谷氨酸溶液加入到甘油中，混合均匀制成γ-聚谷氨酸-甘油混合溶液，灭菌备用；(2)将脱脂棉揉搓制作棉球，并将其置于玻璃培养皿中，玻璃培养皿外用铝箔纸或牛皮纸包裹，灭菌备用；(3)培养待保藏的乳酸菌菌种，得到乳酸菌菌种液；(4)用无菌镊子夹取步骤(2)中制备的无菌棉球浸入步骤(3)培养好的乳酸菌种液中，使棉球吸附充足，然后将吸附有菌液的棉球置于PET离心管中，再用无菌注射器注入步骤(1)中配制的γ-聚谷氨酸-甘油混合液至装满离心管，得到待保藏样品；(5)将步骤(4)得到的待保藏样品低温保藏。上述步骤(1)中所述的γ-聚谷氨酸溶液中γ-聚谷氨酸的重量百分比为3-5％；优选为3％、4％或5％。上述步骤(1)中制备的γ-聚谷氨酸甘油混合溶液中γ-聚谷氨酸溶液与甘油的体积比为5-25：95-75(mL)；优选为5:95、6:94、7:93、8:92、9:91、10:90、11:89、12:88、13:87、14:86、15:85、16:84、17:83、18:82、19:81、20:80、21:79、22:78、23:77、24:76或25:75。上述步骤(1)配置的γ-聚谷氨酸-甘油混合溶液中还加入稳定剂，所述的稳定剂为质量比为2-5:1的十二烷基苯磺酸钠和蛋黄卵磷脂，所述的稳定剂的加入量为每100mLγ-聚谷氨酸-甘油混合溶液中加入2-10g；优选地，所述的稳定剂为质量比为2.5-4.5:1的十二烷基苯磺酸钠和蛋黄卵磷脂，所述的稳定剂的加入量为每100mLγ-聚谷氨酸-甘油混合溶液中加入3-9g；再优选地，所述的稳定剂为质量比为3-4:1的十二烷基苯磺酸钠和蛋黄卵磷脂，所述的稳定剂的加入量为每100mLγ-聚谷氨酸-甘油混合溶液中加入4-6g；为了进一步提高本专利技术公开保藏方法的保藏时限，本专利技术还在γ-聚谷氨酸-甘油混合溶液中加入了质量比为3:1的精氨酸和苯丙氨酸，所述的精氨酸和苯丙氨酸的加入总量为每100mLγ-聚谷氨酸-甘油混合溶液中加入5-20g；优选地，所述的精氨酸和苯丙氨酸的加入总量为每100mLγ-聚谷氨酸-甘油混合溶液中加入8-16g；本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种乳酸菌菌种长期保藏方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)配制γ‑聚谷氨酸溶液，将γ‑聚谷氨酸溶液加入到甘油中，混合均匀制成γ‑聚谷氨酸‑甘油混合溶液，灭菌备用；(2)将脱脂棉制作棉球，并将其置于玻璃培养皿中，玻璃培养皿外用铝箔纸或牛皮纸包裹，灭菌备用；(3)培养待保藏的乳酸菌菌种，得到乳酸菌菌种液；(4)用无菌镊子夹取步骤(2)中制备的无菌棉球浸入步骤(3)培养好的乳酸菌种液中，使棉球吸附充足，然后将吸附有菌液的棉球置于离心管中，再用无菌注射器注入步骤(1)中配制的γ‑聚谷氨酸‑甘油混合液至装满离心管，得到待保藏样品；(5)将步骤(4)得到的待保藏样品低温保藏。

【技术特征摘要】
1.一种乳酸菌菌种长期保藏方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)配制γ-聚谷氨酸溶液，将γ-聚谷氨酸溶液加入到甘油中，混合均匀制成γ-聚谷氨酸-甘油混合溶液，灭菌备用；(2)将脱脂棉制作棉球，并将其置于玻璃培养皿中，玻璃培养皿外用铝箔纸或牛皮纸包裹，灭菌备用；(3)培养待保藏的乳酸菌菌种，得到乳酸菌菌种液；(4)用无菌镊子夹取步骤(2)中制备的无菌棉球浸入步骤(3)培养好的乳酸菌种液中，使棉球吸附充足，然后将吸附有菌液的棉球置于离心管中，再用无菌注射器注入步骤(1)中配制的γ-聚谷氨酸-甘油混合液至装满离心管，得到待保藏样品；(5)将步骤(4)得到的待保藏样品低温保藏。2.根据权利要求1所述的保藏方法，其特征在于：步骤(1)中所述的γ-聚谷氨酸溶液中γ-聚谷氨酸的重量百分比为3-5％。3.根据权利要求1所述的保藏方法，其特征在于：步骤(1)中制备的γ-聚谷氨酸-甘油混合溶液中γ-聚谷氨酸溶液与甘油的体积比为5-25：75-95。4.根据权利要求1所述的保藏方...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁金钟，肖雯娟，林凤祥，
申请(专利权)人：哈尔滨美华生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：黑龙江,23