简单传代培养方案提高双歧杆菌培养浓度的方法技术

本发明专利技术公开了一种简单传代培养方案提高双歧杆菌培养浓度的方法。本发明专利技术发现了双歧杆菌的生长惰性并通过有特点的传代培养方案，通过传代培养活细胞浓度提高了10倍以上，这对于制得高浓度的双歧杆菌发酵剂和益生菌制剂与推广其应用都具有重要的价值，同时对于满足人民对高品质食品需求也具有重要意义，其推广应用将具有良好的社会和经济效益。

【技术实现步骤摘要】
简单传代培养方案提高双歧杆菌培养浓度的方法
本专利技术属于食品加工
，尤其是具体涉及到益生双歧杆菌高浓度培养的方法。
技术介绍
双歧杆菌时人体最有益的益生菌，是肠内最有益的乳酸菌群，且肠道内的双歧杆菌与人的寿命有一定关系。然而，由于年龄的增长、亚健康或者生病，肠内的双歧杆菌会显著减少，所以学者和产业人员采取的对策是生产含双歧杆菌的食品或药品供使用，增加肠道内双歧杆菌的数量，以发挥双歧杆菌的抗衰老、防病之功效。不过双歧杆菌要在人体中发挥作用，其数量必须达到106个/mL以上。所以提高单位培养液的菌株浓度很关键，于是有不少学者通过传统的高密度发酵方法提高双歧杆菌浓度。不过这种方法工艺比较复杂，因此有必要开发新的方法提高其浓度。
技术实现思路
本专利技术的目的是：提供一种简单传代培养方案提高双歧杆菌培养浓度的方法，它能简单有效的通过传代培养活细胞浓度提高了10倍以上，且方法简单易行，成本低廉。本专利技术是这样实现的：简单传代培养方案提高双歧杆菌培养浓度的方法，包括如下步骤：简单传代培养方案提高双歧杆菌培养浓度的方法，包括如下步骤：1)将动物双歧杆菌菌株在改良的PTYG平板培养基培养基中反复划线纯化在体积百分比为20％CO2-80％空气的二氧化碳培养箱中传代培养2-3次，每次平板培养时间是48h，第三次划线获得的活化的纯的单菌落平板，并标记为平板N1)；并将平板N1)密封冷藏2-3天；2)从冷藏了2-3天的平板N1)中挑单菌落进行一次平板划线，培养48h获得单菌落的平板标记为平板N2)；并将平板N2)密封冷藏；然后以此类推获得第三代、第四代、…、第Nn代平板单菌落；当n≥6时，可将第Nn的平板单菌落接种到装有种子培养基后在体积比为20％CO2-80％空气条件下培养24h-48，获得种子液，将种子液按照10％接种量接入改良的PTYG培养基中，在体积比为20％CO2-80％空气条件下发酵培养48h，这样获得的发酵液称为第Nn传代发酵培养液。所述的平板培养基、种子培养基及发酵培养基均为改良PTYG培养基。步骤1)及步骤1)所述的培养的所述的平板培养基的培养的环境为37℃和20％CO2-80％空气的二氧化碳培养箱条件下培养，而双歧杆菌的液态培养的环境可为37℃和20％CO2-80％空气的二氧化碳培养箱条件下培养也可谓37℃温度下密封培养，所有的接种工作都是在普通超净工作台进行。由于采用了上述技术方案，本专利技术发现了双歧杆菌的生长惰性并通过有上述传代培养方案，当n≥6时，第Nn传代发酵培养液的活菌浓度比第N1传代发酵培养液的活菌浓度提高10倍左右。当然为简化过程和节约费用，可按照上述方法在平板传代到获得第N6代平板单菌落时挑单菌落进行种子培养和发酵培养，这样可直接获得高活菌浓度的发酵培养液(活菌浓度比第N1传代发酵培养液的活菌浓度提高10倍)，这对于制得高浓度的双歧杆菌发酵剂和益生菌制剂与推广其应用都具有重要的价值，同时对于满足人民对高品质食品需求也具有重要意义，其推广应用将具有良好的社会和经济效益。具体实施方式本专利技术通过下面的实施例予以进一步说明，但实施例并不限定本专利技术的范围。实施例：简单传代培养方案提高双歧杆菌培养浓度的方法，包括如下步骤：1)将自甘油保藏的动物双歧杆菌菌株BZ25分别在平板培养基培养基中，在体积百分比为20％CO2-80％空气的二氧化碳培养箱中，反复划线纯化3次，每次平板培养时间是48h，第三次划线获得的活化的纯的单菌落平板，并标记为平板N1)；并将平板N1)密封冷藏2-3天；2)从冷藏了2-3天的平板N1)中挑单菌落进行一次平板划线，培养48h获得单菌落的平板标记为平板N2)；并将平板N2)密封冷藏；然后以此类推获得第三代、第四代、…、第Nn代平板单菌落；当n≥6时，可将第Nn的平板单菌落接种到装有种子培养基后在体积比为20％CO2-80％空气条件下培养24h-48，获得种子液，将种子液按照10％接种量接入改良的PTYG培养基中，在体积比为20％CO2-80％空气条件下发酵培养48h，这样获得的发酵液称为第Nn传代发酵培养液。步骤1)及步骤2)所述的平板培养基的培养的环境为37℃和20％CO2-80％空气的二氧化碳培养箱条件下培养，而双歧杆菌的液态培养的环境可为37℃和20％CO2-80％空气的二氧化碳培养箱条件下培养也可谓37℃温度下密封培养，所有的接种工作都是在普通超净工作台进行。本实施例中进行了多代培养，每次在传代培养到20小时时取样测OD值和活菌计数，经过检测，菌株BZ25的获得的从第一代传代发酵培养液的活细胞浓度为5×108CFU/mL，然后的每代传代培养液活菌浓度都是递增，到第6代达到2×1010CFU/mL，比第一代传代培养液提高了1个多数量级，以后的传代的活菌浓度基本稳定。这也说明双歧杆菌存在生长惰性，但可以通过有合适的传代培养方法进行克服。实施例采用的生物样品保藏：BZ25已于2014年12月18日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，该中心地址是：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，其保藏编号分别为CGMCCNO.10225，简称为动物双歧杆菌乳亚种BZ25。本实施例仅以上述菌株作为实施例进行解释，但是，经试验证明，本申请对其它同类菌株也具有效果。本实施例采用的改良PTYG培养基具体组成为：胰蛋白胨5g，大豆蛋白胨5g，酵母粉10g，葡萄糖10g，吐温801mL，L-半胱氨酸盐酸盐0.05g，低聚果糖5g，盐溶液4mL。将各成分加热溶解于1000mL蒸馏水中，过滤，调pH值至6.5，121℃灭菌15min后备用。盐溶液成分和制备：无水CaCl20.2g,K2HPO41.0g,KH2PO41.0g,MgSO4·7H2O0.48g，NaCO310g,NaCl2g。混合CaCl2和MgSO4·7H2O在300mL蒸馏水中直至溶解，加入500mL水，搅拌同时缓慢加入其他盐类，直至溶解。加入200mL蒸馏水，混合后贮存于4℃备用。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种简单传代培养方案提高双歧杆菌培养浓度的方法，其特征在于，包括如下步骤：1)将动物双歧杆菌菌株在改良的PTYG平板培养基培养基中反复划线纯化3次，第三次划线获得的活化的纯的单菌落平板，并标记为平板N1)；并将平板N1)密封冷藏2‑3天；2)从冷藏了2‑3天的平板N1)中挑单菌落进行一次平板划线，培养48h获得单菌落的平板标记为平板N2)；并将平板N2)密封冷藏；然后以此类推获得第三代、第四代、…、第Nn代平板单菌落；当n≥6时，可将第Nn的平板单菌落接种到装有种子培养基后在体积比为20％CO2‑80％空气条件下培养24h‑48，获得种子液，将种子液按照10％接种量接入改良的PTYG培养基中，在体积比为20％CO2‑80％空气条件下发酵培养48h，这样获得的发酵液称为第Nn传代发酵培养液。

【技术特征摘要】
1.一种简单传代培养方案提高双歧杆菌培养浓度的方法，其特征在于，包括如下步骤：1)将动物双歧杆菌菌株在改良的PTYG平板培养基培养基中反复划线纯化3次，第三次划线获得的活化的纯的单菌落平板，并标记为平板N1)；并将平板N1)密封冷藏2-3天；2)从冷藏了2-3天的平板N1)中挑单菌落进行一次平板划线，培养48h获得单菌落的平板标记为平板N2)；并将平板N2)密封冷藏；然后以此类推获得第三代、第四代、…、第Nn代平板单菌落；当n≥6时，可将第Nn的平板单菌落接种到装有种子培养基后在体积比为20％CO2-80％空气条件下培养24h-48，获得种子液，将种子液按照10％接种量接入改良的PTYG培养基中...

【专利技术属性】
技术研发人员：何腊平，邢书奇，李翠芹，张玲，
申请(专利权)人：贵州大学，
类型：发明
国别省市：贵州,52