一株抑制产气荚膜梭菌增殖生长的植物乳杆菌及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一株具有抑制产气荚膜梭菌作用的植物乳杆菌及其应用，其特征在于该菌株命名为植物乳杆菌KLDS1.0391(L.plantarum KLDS1.0391),该菌株保藏于中国微生物菌株保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC No.3151。通过在液体培养基体系中研究，发现该植物乳杆菌KLDS1.0391及其发酵液对产气荚膜梭菌的生长、其孢子的萌发和生长以及孢子的形成均有抑制作用，同时对其活细胞还有一定的杀死功能。将该植物乳杆菌KLDS1.0391接种到发酵风干肠中，发现其对产气荚膜梭菌的生长具有抑制作用，且可杀死全部产气荚膜梭菌，同时发现在发酵风干肠中，该菌株具有较强的抑制其孢子萌发和二次生长的作用。该菌株的发现为抑制发酵肉制品中产气荚膜梭菌生长提供了解决方法。

【技术实现步骤摘要】
一株抑制产气荚膜梭菌增殖生长的植物乳杆菌及其应用
本专利技术涉及微生物
中一株植物乳杆菌对产气荚膜梭菌的抑制作用，以及该菌株在食品中抑菌的应用。
技术介绍
产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens)是一种广泛分布于自然界、人和动物肠道中的厌氧芽胞菌。其生长繁殖的最适温度为37～45℃，该菌能产生毒性烈的外毒素和多种侵袭酶。根据外毒素的性质和致病性的不同，可分为四类：alpha型(CPA)，beta型(CPB)，epsilon型(ETX)和iota型(ITX)；同时根据产外毒素不同，将产气荚膜梭菌分为A、B、C、D、E五个类型。其中，对人类致病的是A、C型，其中A型最常见，引起人类气性坏疽和食物中毒，C型可导致坏死性肠炎。此外，产气荚膜梭菌还可产生其它毒素，如肠毒素(CPE)和beta2型(CPB2)毒素等。由于产气荚膜梭菌广泛分布于自然界及动物肠道中，因此其很容易污染食品，尤其是肉禽制品，从生鲜猪肉、牛肉和鸡肉到各种肉制品，其检出率均在10％以上，鸡肉中检出率甚至达到了84％。除此之外，常用于肉制品配料的香辛料中，也检测到了产气荚膜梭菌的存在。目前因此，有必要找出可在生鲜肉和肉制品中抑制产气荚膜梭菌的物质或途径，以提高肉品生物安全性。植物乳杆菌是乳酸菌的一种，具有很强的发酵食品的能力，与其他乳酸菌制成合剂投放于发酵产品中，可使发酵产品品质、风味、口感更佳。植物乳杆菌主要用于传统食品发酵，是一种非常健康的微生物有机食品原料。在帮助消化的同时，它对缓解肠功能紊乱、肠炎有良好的效果。可预防豆类过敏。植物乳杆菌具有破坏病原菌，保存食物中的营养成份、维生素、抗氧化剂等作用。此外，它还能制造人体所需赖氨酸。利用微生物作为生物保护菌抑制产气荚膜梭菌生长已有报道，Nieto-Lozano等将乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)应用到西班牙发酵干肠中，考察其抑制产气荚膜梭菌生长的能力。结果表明，和对照组相比，接种乳酸片球菌组干肠，在10℃贮藏60d和15℃贮藏30d时，产气荚膜梭菌的数量分别降低了2个和0.8个logCFU/g值。这表明乳酸片球菌可以作为肉制品中优良的生物保护菌，用于抑制产气荚膜梭菌和其它致病菌的生长。但是不同种属的益生菌的益生性能差异性大，因而，开发出一株新的具有抑制产气荚膜梭菌的乳酸菌对于阻断肉制品中产气荚膜梭菌流向人体肠道中也提供了更宽广的思路与选择。
技术实现思路
为改善现阶段抑制发酵肉中产气荚膜梭菌的菌种丰富度不足，本专利技术的目的是公开一株具有抑制产气荚膜梭菌的植物乳杆菌及其应用，其特征包括如下步骤：(1)本专利技术所说的植物乳杆菌KLDS1.0391由东北农业大学乳品重点实验室所提供，并已于2009年6月29日保藏于中国微生物菌株保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCCNo.3151。(2)将本专利技术的植物乳杆菌KLDS1.0391在MRS液体培养基中活化培养至第3代对数中期后，将其接种于8mLmDS-G培养基(产气荚膜梭菌培养基)中，同时添加产气荚膜梭菌，使二者终浓度分别均达到107CFU/mL。37℃厌氧培养24h后，通过平板计数法发现产气荚膜梭菌菌落总数为4.2×105CFU/mL，而植物乳杆菌菌落总数为3.7×108CFU/mL。表明植物乳杆菌可抑制产气荚膜梭菌的增殖，并杀死部分产气荚膜梭菌。(3)将本专利技术的植物乳杆菌KLDS1.0391菌株接种于MRS培养基中活化3代后于对数生长期添加到8mL产气荚膜梭菌生长培养基mDS-G中，使浓度为107CFU/mL，37℃厌氧培养24h后通过过滤除去该菌株，再接种产气荚膜梭菌菌株，使其终浓度达到107CFU/mL。37℃厌氧培养24h后，对产气荚膜梭菌活菌计数，结果测得菌落总数为0，而对照组中产气荚膜梭菌菌落总数为4.9×108CFU/mL。表明植物乳杆菌发酵液能够完全杀死产气荚膜梭菌。(4)将产气荚膜梭菌接种到mDS培养基中，37℃厌氧培养12h，80℃加热30min除去活细胞，制备得到产气荚膜梭菌芽孢。将处于对数生长期的植物乳杆菌添加到8mLmDS-G培养基中，使最终浓度为107CFU/mL，同时添加产气荚膜梭菌芽孢，使其终浓度达到103CFU/mL。37℃厌氧培养24h后测定培养液中植物乳杆菌和产气荚膜梭菌落总数分别为7.7×108CFU/mL和1.2×105CFU/mL，而对照组中产气荚膜梭菌菌落总数为6.8×107CFU/mL，这表明植物乳杆菌抑制了芽孢萌发并进行二次生长。(5)为研究植物乳杆菌发酵液对产气荚膜梭菌芽孢萌发的抑制作用。将产气荚膜梭菌接种到mDS培养基中，37℃厌氧培养12h，80℃加热30min除去活细胞，制备得到产气荚膜梭菌芽孢。将本专利技术的植物乳杆菌KLDS1.0391菌株接种于MRS培养基中活化3代后于对数生长期添加到8mL产气荚膜梭菌生长培养基mDS-G中，使浓度为107CFU/mL，37℃厌氧培养24h后通过过滤除去该菌株，再接种产气荚膜梭菌芽孢，使其终浓度达到103CFU/mL。37℃厌氧培养24h后测定培养液中产气荚膜梭菌落总数1.2×103CFU/mL，而对照组中产气荚膜梭菌菌落总数为7.5×107CFU/mL，这表明植物乳杆菌发酵液对抑制荚膜萌发并进行二次生长具有极强的作用。(6)为研究植物乳杆菌对产气荚膜梭菌芽孢形成的抑制作用，首先将植物乳杆菌与产气荚膜梭菌同时接种于mDS产荚膜培养基中混合培养，37℃厌氧培养24h后，分别测定其中受试菌株数和产气荚膜梭菌芽孢数。发现其对产气荚膜梭菌芽孢的形成并没有明显抑制作用。(7)将植物乳杆菌接种于mDS培养基中，37℃厌氧培养24h后，发现植物乳杆菌生长现象不明显，继续培养至48h后，测定植物乳杆菌菌落数为1.4×107CFU/mL。经过滤除去受试菌株后，接种产气荚膜梭菌，37℃厌氧培养24h后，测定其中形成的芽孢数，结果表明未检测到芽孢的存在。(8)接种前，将植物乳杆菌和产气荚膜梭菌或其芽孢与配料液混合，使得最终肉馅中产气荚膜梭菌菌数为105CFU/g肉料(或芽孢数为102CFU/mL)，植物乳杆菌菌数为107CFU/g肉料。肠馅灌装入肠衣，发酵6d后进行产气荚膜梭菌计数分析，具体方法如下：无菌操作除去风干肠肠衣，取肠馅瘦肉样品10g，加入到90mL灭菌食盐水中，4℃充分振荡30min后梯度稀释，平板计数。最终发现直接接种产气荚膜梭菌的发酵肠中其数量为8.2×103CFU/ml，接种孢子的发酵肠中最终产气荚膜梭菌的数量为6.5×103CFU/ml，表明接种植物乳杆菌可抑制产气荚膜梭菌的增殖并对其有一定的杀死作用，而对产气荚膜梭菌孢子的萌发无明显的抑制能力。(9)以上结果表明本专利技术的植物乳杆菌KLDS1.0391可有效抑制产气荚膜梭菌的增殖，抑制产气荚膜梭菌的生长并对其有一定的杀死作用。(10)针对植物乳杆菌可有效抑制产气荚膜梭菌的增殖，对其发挥抑制产气荚膜梭菌的有效成分进行鉴定，发现为植物乳杆菌产生的抑菌物质和发酵产生的有机酸。(11)本专利技术的植物乳杆菌KLDS1.0391及其发酵液可应用于发酵肉制品中对产气荚膜梭菌进行有效控制。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术做进一步说明，但并不因此将本专利技术限制在所本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一株抑制产气荚膜梭菌增殖生长的植物乳杆菌及其应用，其特征在于所述方法如下：方法一：植物乳杆菌KLDS1.0391可抑制产气荚膜梭菌的增殖，并杀死部分产气荚膜梭菌；方法二：植物乳杆菌KLDS1.0391发酵液可全部杀死产气荚膜梭菌。方法三：植物乳杆菌KLDS1.0391可抑制产气荚膜梭菌孢子萌发并进行二次生长。方法四：植物乳杆菌KLDS1.0391发酵液可十分有效的抑制孢子萌发并进行二次生长，同时可抑制芽孢的形成。方法五：植物乳杆菌KLDS1.0391可抑制发酵风干肠中产气荚膜梭菌的增殖并对其有一定的杀死作用。

【技术特征摘要】
1.一株抑制产气荚膜梭菌增殖生长的植物乳杆菌及其应用，其特征在于所述方法如下：方法一：植物乳杆菌KLDS1.0391可抑制产气荚膜梭菌的增殖，并杀死部分产气荚膜梭菌；方法二：植物乳杆菌KLDS1.0391发酵液可全部杀死产气荚膜梭菌。方法三：植物乳杆菌KLDS1.0391可抑制产气荚膜梭菌孢子萌发并进行二次生长。方法四：植物乳杆菌KLDS1.0391发酵液可十分有效的抑制孢子萌发并进行二次生长，同时可抑制芽孢的形成。方法五：植物乳杆菌KLDS1...

【专利技术属性】
技术研发人员：孔保华，张欢，孙钦秀，陈倩，吴宇桐，
申请(专利权)人：东北农业大学，
类型：发明
国别省市：黑龙江,23