雌酮衍生物、免疫原、抗体、酶标偶联物、检测试剂及其制备方法技术

本发明专利技术涉及一种用于检测生物样本中雌酮含量的雌酮衍生物及其制备方法，所述雌酮衍生物的结构式如式(Ⅰ)所示。使用该雌酮衍生物相继制备得到高免疫原性的雌酮免疫原与相应抗体，该雌酮免疫原特异性强、免疫原性高，抗雌酮特异性抗体特异性强、效价高，能很好地识别并结合雌酮，并且与常见的92种干扰物无任何交叉反应。本发明专利技术还得到雌酮酶标偶联物，并利用抗雌酮特异性抗体和雌酮酶标偶联物制备得到雌酮均相酶免疫检测试剂，该试剂可以方便、快速、准确地测定生物样品中的雌酮含量，同时在全自动生化分析仪上测定多个样品，实现雌酮的高通量、快速化测定，准确度高，特异性强，精确度和检测效率相比之前都有了较大的提高。

【技术实现步骤摘要】
雌酮衍生物、免疫原、抗体、酶标偶联物、检测试剂及其制备方法
本专利技术属于生物检测
，具体涉及一种雌酮衍生物、免疫原、抗体、酶标偶联物、检测试剂及其制备方法。
技术介绍
雌酮(Estrone，E1)的化学结构式如下述式(Ⅳ)所示：雌酮是一种甾体类激素化合物，为天然内源性雌激素，可以从孕妇或孕马的妊娠尿中提取。目前，雌酮检测常用仪器分析的方法，如：气相色谱法、气质联用法、液相色谱法、高效液相色谱法等，这些方法虽然灵敏度较高，检测结果精密度高、准确性好，但是存在样品的前处理较繁琐、测定时间较长、需要配备专门的仪器设备，操作流程复杂，单个样品的检测时间较长，不能快速提供检测结果等缺陷，不适用于临床上大批量样品的检验。如专利申请CN105929014A公开了一种通过质谱法检测雌酮的方法，其对样品经过分离纯化、电离后进行质谱检测，操作方法繁琐，定量分析复杂，单个样品分析时间长，不适合大量样本的批量分析。因此，寻找一种灵敏度高、结果精确，且高通量、快速化，操作简便、成本低廉的雌酮检测方法对临床诊断、食品卫生、环境激素检测等方面都具有重要意义。利用免疫学方法进行雌酮含量测定是一种极具应用前景的新技术，目前利用免疫方法检测雌酮的原理是：由于雌酮上没有可以直接连接上标记分子的官能团，需要经过化学合成的方法引入可以直接连接上标记分子的结构(称为连接臂，末端官能团可以为羧基、氨基等)，得到雌酮衍生物。接着，通过化学方法将雌酮衍生物的连接臂连接到标记分子上，制备成雌酮标记分子。在检测过程中，雌酮标记分子与待测样本中的雌酮竞争结合雌酮抗体，利用标记分子直接或者间接产生的光信号，通过赋值校准，获得待测雌酮衍生物的浓度值，从而完成对待测样本中雌酮含量的测定。由此可见制备灵敏度高、特异性强的雌酮特异性抗体和雌酮酶标偶联物是实现该技术的关键所在。均相酶免疫检测技术可以方便、快速、准确地确定生物样品中的雌酮含量，并且可以在全自动生化分析仪上同时测定多个样品，实现雌酮的高通量、快速化测定，准确度高，特异性强，精确度和检测效率相比之前都有了较大的提高。专利申请CN107652343A公开了雌醇衍生物及其衍生物与试剂盒在检测雌醇含量中的应用，但是该雌醇衍生物制备成的试剂检测雌醇含量时与市售已知试剂盒相比相关性仅为0.983，存在一定的误差。
技术实现思路
基于上述现有技术的缺陷，本专利技术提供一种全新的雌酮衍生物，通过该衍生物制备得到的抗体效价较高、特异性强；另一方面该雌酮衍生物与葡萄糖-6-磷酸脱氢酶偶联得到雌酮酶标偶联物，上述雌酮特异性抗体与雌酮酶标偶联物共同制备为均相酶免疫检测试剂，能够很好的识别并检测雌酮，并且与常见的92种干扰物无任何交叉反应，检测方法简单、迅速、特异性强、实现大批量样品全自动检测。本专利技术提供一种雌酮衍生物，其结构式如下述式(Ⅰ)所示：进一步地，所述雌酮衍生物的制备方法包括以下步骤：(1)化合物3的合成(2)雌酮衍生物的合成进一步地，所述步骤(1)的具体方法为：化合物1与化合物2溶解于丙酮中，然后加入K2CO3，制成反应混合溶液，加热回流后过滤，再将去除溶剂后得到的剩余物通过硅胶纯化柱进行纯化，得化合物3。进一步地，所述步骤(2)的具体方法为：化合物3、化合物4、三苯基膦(PPh3)溶解于四氢呋喃(THF)中，然后加入偶氮二甲酸二异丙酯(DIAD)，制成反应混合溶液，搅拌反应，过滤反应液，再将去除溶剂后得到的剩余物通过硅胶纯化柱进行纯化，得本专利技术的雌酮衍生物。本专利技术还提供一种雌酮免疫原，由上述雌酮衍生物与载体连接而成，其结构式如下述式(Ⅱ)所示：其中，所述载体为具有免疫原性的蛋白质或多肽，选自血清蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白或甲状腺球蛋白中的一种。其中载体优选为血清蛋白。其中载体更优选为牛血清白蛋白。进一步地，所述雌酮免疫原的制备方法包括以下步骤：(1)配制缓冲液A：按照重量份数计，2.3-3.2份磷酸二氢钾、3.8-4.5份磷酸氢二钠、8.0-9.0份氯化钠、0.7-1.3份氯化镁，溶解于900-1100份水中，调节pH至8.0-8.5；(2)将载体溶解于缓冲溶液A中，制成载体溶液；(3)将式(I)所示的雌酮衍生物，溶解于缓冲溶液A中，制成雌酮衍生物溶液；(4)将雌酮衍生物溶液逐滴加入上述载体溶液中，搅拌得到混合溶液A；(5)将混合溶液A用上述缓冲溶液A进行透析，即得雌酮免疫原溶液。更进一步地，所述雌酮免疫原的制备方法包括以下步骤：(1)配制缓冲液A：称取2.72g磷酸二氢钾、4.26g磷酸氢二钠、8.5g氯化钠、0.95g氯化镁，共同溶解于1L去离子水中，调节pH至8.0-8.5；(2)将蛋白质载体在-2～-8℃下溶解于缓冲溶液A中，制成0.5-2mg/ml的载体溶液；(3)将式(Ⅰ)所示的雌酮衍生物在-2～-8℃下溶解于缓冲溶液A中，制成8-12mg/ml雌酮衍生物溶液；(4)将雌酮衍生物溶液逐滴加入上述载体溶液中，然后将此混合溶液在-2～-8℃下搅拌2-5小时，得到混合溶液A；(5)将混合溶液A用上述缓冲溶液A进行透析，透析后所得溶液即为雌酮免疫原溶液，加入质量分数0.05-0.15％的NaN3，于-18～-22℃下储存。本专利技术进一步提供一种抗雌酮特异性抗体，由上述雌酮免疫原通过免疫实验动物后产生，所述抗体为完整抗体分子，或者为保留与雌酮特异性结合能力的抗体片段或抗体衍生物。进一步地，所述实验动物为兔、山羊、小鼠、绵羊、豚鼠或马中的一种。更进一步地，所述实验动物为兔。进一步地，所述抗雌酮特异性抗体的制备方法包括以下步骤：(1)用PBS缓冲液稀释式(II)所示的雌酮免疫原，得到抗原溶液，将抗原溶液与弗氏完全佐剂混合，对实验动物进行注射；(2)2-5周后，将抗原溶液与弗氏不完全佐剂混合，对实验动物再次进行注射；(3)对免疫后的实验动物取血，分离纯化得到抗雌酮特异性抗体。更进一步地，所述抗雌酮特异性抗体的制备方法包括以下步骤：(1)用PBS缓冲液(pH7.2-7.6)将上述式(Ⅱ)所示的雌酮免疫原稀释至1.0-3.0mg/ml，得到抗原溶液，然后用1-3ml抗原溶液与弗氏完全佐剂等体积混合，对实验动物进行注射；(2)2-5周后，再用1-3ml上述抗原溶液与弗氏不完全佐剂等体积混合，对上述实验动物进行注射，之后每隔2-5周注射一次，共计注射3-8次；(3)对免疫后的实验动物取血，分离纯化得到效价为1:50000-1:80000的抗雌酮特异性抗体。本专利技术还提供一种雌酮酶标偶联物，由式(I)所示的雌酮衍生物与葡萄糖-6-磷酸脱氢酶连接而成，其结构式如下述式(Ⅲ)所示：进一步地，所述雌酮酶标偶联物的制备方法包括以下步骤：(1)制备缓冲溶液B：按照重量份数计，0.85-1.30份磷酸二氢钾、1.2-2.0份磷酸氢二钠、8.0-9.0份氯化钠、0.7-1.3份氯化镁，溶解于900-1100份水中，调节pH8.0-8.5；(2)将葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶解于缓冲溶液B，制成葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶液；(3)将式(I)所示的雌酮衍生物溶解于缓冲溶液B中，制成雌酮衍生物溶液；(4)将雌酮衍生物溶液逐滴加入上述葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶液中，搅拌得到混合溶液B；(5)将混合溶液B用上述缓冲溶液B进行透析，透析后所得溶液即为雌酮酶标偶本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种雌酮衍生物，其结构式如下述式(Ⅰ)所示：

【技术特征摘要】
1.一种雌酮衍生物，其结构式如下述式(Ⅰ)所示：2.一种权利要求1所述的雌酮衍生物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)化合物3的合成(2)雌酮衍生物的合成其中，所述步骤(1)的具体方法为：将化合物1与化合物2溶解于丙酮中，然后加入K2CO3，制成反应混合溶液，加热回流后过滤，再将去除溶剂后得到的剩余物通过硅胶纯化柱进行纯化，得到化合物3；所述步骤(2)的具体方法为：将化合物3、化合物4与三苯基膦溶解于四氢呋喃中，然后加入偶氮二甲酸二异丙酯，制成反应混合溶液，搅拌反应，过滤反应结束后的溶液，再将去除溶剂后得到的剩余物通过硅胶纯化柱进行纯化，得到雌酮衍生物。3.一种雌酮免疫原，其特征在于，由权利要求1所述的雌酮衍生物或权利要求2所述的制备方法制备得到的雌酮衍生物与载体连接而成，其结构式如下述式(Ⅱ)所示：其中，所述载体为具有免疫原性的蛋白质或多肽，选自血清蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白或甲状腺球蛋白中的一种，优选为血清蛋白，更优选为牛血清白蛋白。4.一种权利要求3所述的雌酮免疫原的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)配制缓冲液A：按照重量份数计，2.3-3.2份磷酸二氢钾、3.8-4.5份磷酸氢二钠、8.0-9.0份氯化钠、0.7-1.3份氯化镁，溶解于900-1100份水中，调节pH至8.0-8.5；(2)将载体溶解于缓冲溶液A中，制成载体溶液；(3)将式(Ⅰ)所示的雌酮衍生物，溶解于缓冲溶液A中，制成雌酮衍生物溶液；(4)将雌酮衍生物溶液逐滴加入上述载体溶液中，搅拌得到混合溶液A；(5)将混合溶液A用上述缓冲溶液A进行透析，即得雌酮免疫原溶液。5.一种抗雌酮特异性抗体，其特征在于，由权利要求3所述的雌酮免疫原或权利要求4所述制备方法制备得到的雌酮免疫原通过免疫实验动物后产生；所述抗体为完整抗体分子，或者为保留与雌酮特异性结合能力的抗体片段或抗体衍生物；所述实验动物为兔、山羊、小鼠、绵羊、豚鼠或马中的一种，优选为兔。6.一种权利要求5所述的抗雌酮特异性抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)用PBS缓冲液稀释式(II)所示的雌酮免疫原，得到抗原溶液，将抗原溶液与弗氏完全佐剂等体积混合，对实验动物进行注射；(2)2-5周后，再用上述抗原溶液与弗氏不完全佐剂等体积混合，对上述实验动物进行注射，之后每隔2-5周注射一次，共计注射3-8次；(3)对免疫后的实验动物取血，分离纯化得到抗雌酮特异性抗体。7.一种雌酮酶标偶...

【专利技术属性】
技术研发人员：虞留明，谢江涛，陈学东，郭进京，
申请(专利权)人：苏州博源医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32