本发明专利技术公开了mir‑99a在制备抑制心肌梗死后炎症反应药物中的应用。相对于现有技术，本发明专利技术提供了mir‑99a在制备抑制心肌梗死后炎症反应药物中的应用，所述mir‑99a能够抑制心肌梗死边缘区TRB2蛋白水平表达，具体为一方面促进IL10表达，进而下调IL6的表达，减少心肌炎症发生，另一方面上调C/EBPβ的表达，促进Mφ向M2转化，甚至可能促进Mφ的M1向M2型转化，进一步抑制炎症反应，具有显著的效果。
Application of mir-99a in the preparation of anti-inflammatory drugs after myocardial infarction
The invention discloses the application of Mir 99A in the preparation of anti-inflammatory drugs after myocardial infarction. Compared with the existing technology, the invention provides the application of Mir 99A in the preparation of anti-inflammatory drugs after myocardial infarction. The Mir 99A can inhibit the expression of TRB2 protein in the marginal zone of myocardial infarction, promote the expression of IL10 on the one hand, then down-regulate the expression of IL6, reduce myocardial inflammation, on the other hand, up-regulate the expression of C/EBPbeta, promote the transformation of Mphi to M2, or even can. It can promote the transformation of M 1 to M2 and further inhibit inflammation. It has significant effect.
【技术实现步骤摘要】
mir-99a在制备抑制心肌梗死后炎症反应药物中的应用
：本专利技术公开了mir-99a在制备抑制心肌梗死后炎症反应药物中的应用，属于mir-99a新用途
背景内容：心肌梗死是慢性心力衰竭的主要原因之一，防治心力衰竭的支出占每年总医疗健康支出的1-2％，心梗后心肌的炎症反应是导致心梗后心脏重构和心衰的重要病理生理机制。心肌梗死发生早期，产生强烈而短暂的炎症反应，能够在早期促使梗死区域死亡细胞和细胞外基质碎片的清除，但是损伤心肌随后必须尽快进入增殖期、瘢痕修复期，过度的炎症反应可导致心室扩大，心脏泵功能衰竭，甚至增加非新发冠脉事件死亡率。目前仍缺乏针对心肌梗死后心肌炎症有效治疗措施。
技术实现思路
：专利技术目的：为解决上述技术问题，本专利技术提供了mir-99a在制备抑制心肌梗死后炎症反应药物中的应用，为开发治疗心梗后炎症反应的药物提供依据。技术方案：为达到上述专利技术目的，本专利技术技术方案如下：mir-99a在制备抑制心肌梗死后炎症反应药物中的应用。所述mir-99a的成熟体，如下所示：人类hsa-miR-99a-5p：AACCCGUAGAUCCGAUCUUGUG；小鼠mmu-miR-99a-5p：AACCCGUAGAUCCGAUCUUGUG。人类和小鼠的mir-99a的mir-RNA的编码序列完全一致。进一步地，本专利技术提供了所述mir-99a在制备抑制心肌梗死边缘区TRB2蛋白水平表达药物中的应用。所述mir-99a能够减少心肌梗死炎症反应，减少心脏破裂风险，改善心功能。所述mir-99a高表达一方面促进IL10表达，进而下调IL6的表达，减少心肌炎症发生。所述mir-99a高表达另一方面上调C/EBPβ的表达，促进Mφ向M2转化，甚至可能促进Mφ的M1向M2型转化，进一步抑制炎症反应。所述mir-99a是可以很容易合成的，简单人工修饰后，比如3‘端用两个TT修饰或是另外用其它功能基团修饰，这样可以增强人工合成的miRNAmimics的抗降解性能，更能较持久发挥作用，能够作为治疗心肌梗死后炎症过度反应的药物，达到改善心梗后心功能，减少心脏破裂发生的目的。技术效果：相对于现有技术，本专利技术提供了mir-99a在制备抑制心肌梗死后炎症反应药物中的应用，所述mir-99a能够抑制心肌梗死边缘区TRB2蛋白水平表达，具体为一方面促进IL10表达，进而下调IL6的表达，减少心肌炎症发生，另一方面上调C/EBPβ的表达，促进Mφ向M2转化，甚至可能促进Mφ的M1向M2型转化，进一步抑制炎症反应，具有显著的效果。附图说明图1为小鼠立体心脏的实物图及其图注射后生存情况图：小鼠行结扎前降支造成心肌梗死模型，随机分组，分别向心肌梗死边缘区注射高表达mir-99a的慢病毒(Lenti-99a-GFP)和载有无效序列的阴性对照病毒(Lenti-GFP)(为无效序列，小鼠体内无对应的编码)，在观察4周内小鼠的生存情况。Lenti-GFP组的小鼠术后4周生存率约为60％，而经mir-99a高表达处理的Lenti-99a-GFP组小鼠术后4周生存率高达88％；图2.小鼠心肌梗死后心脏组织染色和炎症因子检测图：在心肌梗死边缘区高表达mir-99a能够减少心肌梗死区和梗死周围区炎性细胞浸润，减少梗死面积，增加瘢痕的厚度(2A-B)。心肌梗死周围区ARG1在mRNA水平上表达上调6倍，IL10在mRNA水平上调5倍左右(图2C)图3.mir-99a抑制TRB2表达调控心肌梗死后炎症反应图：用荧光酶素报告基因方法验证了小鼠中TRB2是mir-99a的靶基因。慢病毒载体携带mir-99a以及在体心脏中成功感染高表达mir-99a(慢病毒-99a)，阴性对照慢病毒(慢病毒-NC)，且高表达mir-99a能够抑制心肌梗死边缘区TRB2(TRIB2)的蛋白水平表达。具体实施方式下面结合附图和具体实例，进一步阐明本专利技术，应理解这些实例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围，在阅读了本专利技术之后，本领域技术人员对本专利技术的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。实施例一、试验方法1.结扎前降支构建小鼠心肌梗死模型1)购买雄性6周龄清洁级C57/BL6小鼠和饲养的转基因小鼠，饲养于南京大学医学院附属鼓楼医院动物实验中心1周以适应环境。实验动物于人工条件下饲养，室温为22℃，采用12小时明/暗光照周期，可自由饮水和进食。2)将小鼠腹腔注射氯胺酮和阿托品配制的复合麻醉剂。充分麻醉后将其固定于手术板上，气管插管并连接呼吸机。于左侧胸骨第3肋间作横行切口，暴露心脏，找到左心耳，在左心耳中下处1mm左右沿垂直于冠状动脉走行方向用7-0缝线结扎冠状动脉，sham组小鼠则同法开胸，但不结扎冠状动脉。模型组小鼠按分组于1小时、3小时、1天、3天、7天、28天、44天取梗死区心肌组织(每组每一时间点6-8只)；假手术组小鼠亦按分组于不同时间点相应地取心肌组织，各样本均约2mm×2mm×2mm。每组留取2-3只行免疫组化检查。其余组织快速通过液氮,一部分置于Trizol中用于立即提取总RNA，一部分用于提取蛋白试验。3)体内心肌内注射mir-99a能够在心脏组织特异性高表达：心肌梗死区和边缘区注射高表达mir-99a的慢病毒，分为3-5个点分次注射总共25ul(2.5*10^8个)的慢病毒，1周后处死小鼠，通过PCR检测心、肝、脾、肺、肾、脑等组织器官中mir-99a的表达情况。前期实验证实，心肌局部注射的方法能够心脏高表达mir-99a，而其他组织表达无改变。检测方法：RT-PCR，检测采用TaqManmircroRNAAssays(产品号4395470、4427975)。2、mir-99a对小鼠心肌梗死后炎症反应的抑制作用(1)RT-PCR检测IL10、IL6的表达情况。(2)血清学检测ELISA检测IL10、IL6的表达情况。(3)、探究巨噬细胞极化改变情况：1)免疫荧光检测巨噬细胞分布：OCT包埋的组织制成3μM的切片，-20度保存备用②取出切片，常温放置5分钟复温③4％多聚甲醛固定常温下固定10分钟④PBS清洗5分钟×3遍⑤0.5％的Triton穿透15分钟⑥PBS清洗5分钟×3遍⑦5％的PBA(2.5gBSA和50ml的PBS)常温下封闭30分钟⑧加入1％的BSA稀释一抗(F4/80，iNOS)，4℃冷库孵育过夜⑨PBS清洗5分钟×3遍⑩加入1％的BSA稀释的二抗(1：100)，常温下避光孵育1小时；PBS清洗5分钟×3遍；含DAPI封片剂封片。荧光显微镜下观察结果。2)巨噬细胞在心肌梗死后心脏中表达：1)免疫荧光法：CD68+为巨噬细胞标记；此外分别用CD11c标记巨噬细胞M1型，CD206标记巨噬细胞M2型，则M1/M2比值研究巨噬细胞浸润情况2)qt-PCR检测巨噬细胞相关标记物表达：ARG1、LYVEL、CD163、MRC1、MCP1、CINC1、FASLG、IFN-γ、L-SELECTIN、MIP3A、MMP8、CXCL7；3)巨噬细胞M1、M2极化情况：wenstern检测ARG1表达；4)流式细胞检测心脏中M1、M2极化情况：使用gentleMACS全自动组织处理器(德国美天旎公司)分离出心脏梗死区、梗死边缘区、外周区的巨噬细本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.mir‑99a在制备抑制心肌梗死后炎症反应药物中的应用。
【技术特征摘要】
1.mir-99a在制备抑制心肌梗死后炎症反应药物中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述mir-99a在制备抑制心肌梗死边缘区TRB2蛋白水平表达药物中的应用。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述mir-99a能够促进IL10表达，进而下调IL6的表达。4.根据权利要求2所述的应用，其特征在...
【专利技术属性】
技术研发人员：李巧玲，
申请(专利权)人：南京鼓楼医院，
类型：发明
国别省市：江苏,32
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。