一种北芪菇中硒代蛋氨酸的提取纯化与检验方法技术

本发明专利技术公开了一种北芪菇中硒代蛋氨酸的提取纯化与检验的方法，涉及北芪菇中氨基酸的提取纯化与检验领域，以北芪菇为原料，加入5%的硝酸溶液，料液比为1:6，离心，沉淀物质加入Tris‑Hcl，超声处理，酶解36小时，离心10min，取上清液，超滤离心抽滤，得到粗提液，以正丁醇：乙酸：水=7:1:2为展开剂，经薄层层析展开分离纯化硒代蛋氨酸，用色谱甲醇和超纯水作为流动相，用质谱仪测定样品分子质量信息，用红外检测其官能团，并分析其分子结构，双紫外分光光度计测定含量，旋光仪测定旋光度和比旋光度，待溶液蒸发结晶后测定熔点。本发明专利技术方法不易破坏低含量的敏感氨基酸硒代蛋氨酸，提取效率高，灵敏度高，是一种操作简单、效率高的提取纯化与检测的方法。

A Method for Extraction, Purification and Detection of Selenomethine from Astragalus membranaceus

The invention discloses a method for extracting, purifying and testing selenomethionine in Beiqi mushroom, which relates to the field of extraction, purification and testing of amino acids in Beiqi mushroom. Beiqi mushroom is used as raw material, and 5% nitric acid solution is added, the ratio of material to liquid is 1:6, centrifugation, precipitation material is added to Tris_Hcl, ultrasonic treatment, enzymatic hydrolysis for 36 hours, centrifugation for 10 minutes, supernatant is extracted, ultrafiltration and centrifugation is used to extract Selenomethine was separated and purified by TLC with n-butanol: acetic acid: water = 7:1:2 as developing agent, methanol and ultra-pure water as mobile phase. Molecular mass information of the sample was determined by mass spectrometer, functional groups were detected by infrared spectroscopy, molecular structure was analyzed, content was determined by dual-ultraviolet spectrophotometer, optical rotation and specific rotation were determined by polarimeter, and evaporation of the solution was awaited. The melting point was determined after crystallization. The method of the invention is not easy to destroy the low content of the sensitive amino acid selenomethionine, has high extraction efficiency and sensitivity, and is a simple and efficient extraction, purification and detection method.

【技术实现步骤摘要】
一种北芪菇中硒代蛋氨酸的提取纯化与检验方法
本专利技术涉及北芪菇中氨基酸的提取纯化与检验领域，具体为一种北芪菇中硒代蛋氨酸的提取纯化与检验方法。
技术介绍
北芪菇，担子菌门下伞菌目侧耳属平菇，利用山西省浑源县74km2富硒地区的地理资源优势，以北岳恒山正宗正北芪边角料和多种中草药及农作物副产品为培养料经多年培育而成的侧耳属平菇，是山西浑源富硒地区开发的新型食用菌。根据生物富集作用，北芪菇内含浑源黄芪的药理成分，在生长发育过程中对黄芪苷有一定程度的富集，北芪菇中检测到含有微量元素硒、人体必须的8中氨基酸含量都比较高，而且仅赖氨酸一项就达1.185%，多糖9.688%，硒0.54ppm，锌77.77ppm，并含有多种维生素和无机盐类物质，其营养成份远超于普通平菇，含有较高的食用价值和药用价值；具有脱气排脓、补气固表、强身健体、保护肝脏、催乳、润肤等多种功能。硒是人体所必需的一种微量元素，提高人体免疫力，预防多种疾病，在机体中有重要的生理作用。硒是谷胱甘肽过氧化酶等的必需组成部分，同时又是体内许多蛋白质的组成成分，对动物机体抗氧化、抗应激、提高免疫力等起着重要的作用。在植物生长过程中，向环境中添加无机硒可以通过植物自身的生物代谢将环境中的无机硒转化为植物组织中的有机含硒化合物，通过含硒植物补硒是缺硒地区提高人体硒水平的有效方法。植物体中的硒主要以有机硒和无机硒的形式存在，而相对于无机硒化合物，有机形态的硒化合物通常具有较高的生理功能及较低的毒性，如硒蛋白、硒代氨基酸。有机硒的基本存在形式为硒蛋白。硒仅以硒代半胱氨酸(selenocysteine，SeCys)和硒代蛋氨酸(selenomethionine，SeMet)两种形式共价结合在蛋白质中。北芪菇内丰富的赖氨酸（1.19g/100g）和硒（0.54ppm/100g）可能与吡咯赖氨酸和L-硒代半胱氨酸或L-硒-甲基硒代半胱氨酸的生物合成存在着密切的关系，有望在抑制肿瘤、抗氧化、辅助治疗心血管疾病、解毒排毒等方面进行开发。由于硒代蛋氨酸含量较少，而同系物的其他氨基酸含量则要比硒代蛋氨酸含量高几千倍，形成严重干扰，因此对硒代蛋氨酸的分析一直是分析工作者的难题之一。现有采用PC、TLC技术鉴定了硒代胱氨酸和硒代蛋氨酸，溴化氢GC法测定硒代蛋氨酸，但是由于硒代蛋氨酸为敏感氨基酸且含量往往较低，用HCl水解时，特别是有碳氢化合物存在时，很容易遭到破坏，溶剂噪音对结果有较大影响，提取纯化的操作繁琐、结果不可靠等问题。为解决北芪菇中硒代蛋氨酸的提取纯化与检验操作繁琐，易受到干扰结果不可靠的问题，本专利技术提供了一种易于操作、试验耗时短且提取效率高、较温和的北芪菇中硒代蛋氨酸提取纯化与检测的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种测定北芪菇中硒代蛋氨酸提取纯化和检验的方法，用以克服上述技术缺陷。本专利技术是通过如下技术方案来实现的：一种测定北芪菇中硒代蛋氨酸含量的方法，以北芪菇为原料，采用酶解法对硒代蛋氨酸进行粗提取，经薄层层析法分离纯化后，利用质谱、红外质谱及紫外检测标准品和供试品并测定含量，测定旋光度和比旋光度，结晶后测定其熔点；具体为：以北芪菇为原料，粉碎筛选，加入5%的硝酸溶液，料液比为1:6，离心操作，沉淀物质加入Tris-Hcl，超声处理，酶解36小时，离心10min，取上清液，超滤离心，抽滤，得到粗提液；以正丁醇：乙酸：水=7:1:2为展开剂，经薄层层析展开分离纯化硒代蛋氨酸，用色谱甲醇和超纯水作为流动相，用质谱仪测定样品分子质量信息，用红外检测其官能团，并分析其分子结构，利用双紫外分光光度计测定含量，利用旋光仪测定旋光度和比旋光度，待溶液蒸发结晶后测定熔点。进一步地，具体过程为：步骤a，以北芪菇为原料，粉碎筛选，加入5%的硝酸溶液，料液比为1:6，离心操作，保留沉淀物质，加入0.5mmol/L的Tris-Hcl，超声处理，每隔12h依次加入胰蛋白酶、蛋白酶K，在37℃下振荡酶解36小时；随后离心10min，取上清液，用截留分子量为3KD的超滤离心，除去蛋白酶及大分子物质，用0.45um的滤膜抽滤，得到粗提液；步骤b，L-硒代蛋氨酸标准品加色谱纯甲醇溶解，定容，充分溶解后得到1mg/mL的L-硒代蛋氨酸标准品溶液，并将其置于2～4℃的冰箱中保存备用；步骤c，将层析板加热活化并冷却后，分别吸取粗提液及标准品溶液25μL，在距底边2cm水平线上均匀点样，加样后原点扩散直径不超过3mm，干后再点一次；以正丁醇：乙酸：水=7:1:2为北芪菇供试品展开剂，密封后，预饱和20min，放入层析缸中上行展开，待展开剂前沿距层析板顶端0.8-1.2cm处时，取出晾干，将显色后的层析板放入薄层色谱成像系统，于紫外波长365nm下对层析检视，标志，将展好的层析板用茚三酮溶液喷涂，使之显色，在紫外灯下标记，对比计算Rf值，系统拍照，并标志；步骤d，用色谱甲醇和超纯水作为流动相，用微量进样器吸取一定量的标准品溶液，进样，对谱图进行分析、保存；将供试品层析板置于TLC-质谱接口上，使激光对准圈出的待测斑点中心处，取样，对谱图进行分析、保存；步骤e，打开傅里叶红外光谱仪，测试背景，用毛细管吸取标准品溶液于点样中心处，测试样品，对红外谱图进行处理分析，轻刮层析板上的待测斑点置于烧杯中，加入色谱甲醇，过滤、取滤液，制得待测液，观察待测液的红外检测方法与标准品的检测是否相同；步骤f，将待测液放入双紫外分光光度计中，甲醇为参照，设置扫描范围为200～700nm，光谱扫描，得到紫外扫描图谱、最大吸收峰值；将L-硒代蛋氨酸标准品配置成0.05-0.25mg/mL的溶液，设置浓度梯度在最大吸收峰值下作出一条标准曲线测定各滤液浓度和吸光值；步骤g，取待测液分别测定旋光度和比旋光度，记录数据；步骤h，将待测液蒸发结晶后测定其熔点。与现有技术相比较本专利技术的有益效果在于：采用较温和的酶解法分解蛋白质，避免了硒代蛋氨酸为敏感氨基酸且含量往往较低，用HCl水解时，特别是有碳氢化合物存在时，很容易遭到破坏的问题，该方法不造成目标物质的损失，而且操作简单、用时短，避免了被其他高含量氨基酸的干扰，大大的提高了提取效率。薄层层析相对于纸色谱法、高效液相色谱、高效气相色谱和高速逆流色谱法保持了操作方便、设备简单、显色容易等特点，同时展开速率快，一般仅需15～20分钟；混合物易分离，分辨力一般比以往的纸层析高10～100倍，既适用于只有0.01μg的样品分离，又能分离大于500mg的样品作制备用，而且还可以使用如浓硫酸、浓盐酸之类的腐蚀性显色剂，能实现对硒代蛋氨酸的分离纯化，使得硒代蛋氨酸准确分离，不被其他高含量氨基酸干扰，MS和IR联用对其质荷比和所含官能团进行表征与分析，准确度高，避免干扰。TLC-MS-IR联用能实现从微克量级的分离分析，易于操作、试验耗时短且提取效率高、较温和的北芪菇中硒代蛋氨酸提取纯化与检测的方法。适用于从北芪菇中进行物质的制备分离。附图说明图1为本专利技术的含量测定的流程图。图2为F254层析板L-硒代蛋氨酸标准品显色后TLC图像，图中1为L-硒代蛋氨酸所在斑点位置。图3为F254层析板北芪菇提取液显色前TLC图像，图中1为L-硒代蛋氨酸所在斑点位置。图4为F254层析板北芪菇提取液显色后TLC图本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种测定北芪菇中硒代蛋氨酸含量的方法，其特征在于，以北芪菇为原料，采用酶解法对硒代蛋氨酸进行粗提取，经薄层层析法分离纯化后，利用质谱、红外质谱及紫外检测标准品和供试品并测定含量，测定旋光度和比旋光度，结晶后测定其熔点；具体为：以北芪菇为原料，粉碎筛选，加入5%的硝酸溶液，料液比为1:6，离心操作，沉淀物质加入Tris‑Hcl，超声处理，酶解36小时，离心10min，取上清液，超滤离心，抽滤，得到粗提液；以正丁醇：乙酸：水=7:1:2为展开剂，经薄层层析展开分离纯化硒代蛋氨酸，用色谱甲醇和超纯水作为流动相，用质谱仪测定样品分子质量信息，用红外检测其官能团，并分析其分子结构，利用双紫外分光光度计测定含量，利用旋光仪测定旋光度和比旋光度，待溶液蒸发结晶后测定熔点。

【技术特征摘要】
1.一种测定北芪菇中硒代蛋氨酸含量的方法，其特征在于，以北芪菇为原料，采用酶解法对硒代蛋氨酸进行粗提取，经薄层层析法分离纯化后，利用质谱、红外质谱及紫外检测标准品和供试品并测定含量，测定旋光度和比旋光度，结晶后测定其熔点；具体为：以北芪菇为原料，粉碎筛选，加入5%的硝酸溶液，料液比为1:6，离心操作，沉淀物质加入Tris-Hcl，超声处理，酶解36小时，离心10min，取上清液，超滤离心，抽滤，得到粗提液；以正丁醇：乙酸：水=7:1:2为展开剂，经薄层层析展开分离纯化硒代蛋氨酸，用色谱甲醇和超纯水作为流动相，用质谱仪测定样品分子质量信息，用红外检测其官能团，并分析其分子结构，利用双紫外分光光度计测定含量，利用旋光仪测定旋光度和比旋光度，待溶液蒸发结晶后测定熔点。2.根据权利要求1所述的一种测定北芪菇中硒代蛋氨酸含量的方法，其特征在于，该具体过程为：步骤a，以北芪菇为原料，粉碎筛选，加入5%的硝酸溶液，料液比为1:6，离心操作，保留沉淀物质，加入0.5mmol/L的Tris-Hcl，超声处理，每隔12h依次加入胰蛋白酶、蛋白酶K，在37℃下振荡酶解36小时；随后离心10min，取上清液，用截留分子量为3KD的超滤离心，除去蛋白酶及大分子物质，用0.45um的滤膜抽滤，得到粗提液；步骤b，L-硒代蛋氨酸标准品加色谱纯甲醇溶解，定容，充分溶解后得到1mg/mL的L-硒代蛋氨酸标准品溶液，并将其置于2～4℃的冰箱中保存备用；步骤c，将...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨卫民，张利军，秦永其，赵青红，杜京旗，
申请(专利权)人：吕梁学院，
类型：发明
国别省市：山西,14