一种北芪菇中黄芪苷的提取纯化与检验方法技术

本发明专利技术公开了一种北芪菇中黄芪苷的提取纯化与检验的方法，涉及北芪菇中活性物质提取纯化与检验领域，以70%的乙醇为提取剂，经微波超声波辅助萃取仪辅助处理后获得黄芪苷粗提取液，以氯仿、甲醇、乙酸乙酯、水混合溶液为展开剂，经薄层层析展开分离纯化黄芪甲苷、黄芪皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，用色谱甲醇和超纯水作为流动相，用高分辨质谱仪准确测定样品分子质量信息（分子离子或碎片离子的质荷比），用红外检测其官能团，并分析了其分子结构，最后测定其旋光度、比旋光度和熔点。应用TLC‑MS‑IR串联技术检测北芪菇中的黄芪苷，能实现从微克量级的分离分析到克量级的分离制备，是一种操作简单、用时短，效率高的提取纯化与检测的方法。

【技术实现步骤摘要】
一种北芪菇中黄芪苷的提取纯化与检验方法
本专利技术涉及北芪菇中活性物质的提取纯化与检验领域，具体为一种北芪菇中黄芪苷的提取纯化与检验方法。
技术介绍
北芪菇，担子菌门下伞菌目侧耳属平菇，将正北芪、多种中草药、农作物副产品作培养料，采用科学的配方和特殊的工艺多年培育而成的新型侧耳属平菇，是山西浑源富硒地区开发的新型食用菌。根据生物富集作用，北芪菇内含浑源黄芪的药理成分，在生长发育过程中对黄芪苷有一定程度的富集。北芪菇中含有多种人体必需的氨基酸、多糖蛋白、抗生素、牛黄酸、菌糖、多种酶、维生素以及硒元素，是全能营养型的食用菌，其营养成份远超于普通平菇，含有较高的食用价值和药用价值。北芪菇具有较强的生物转化作用，其重要的代谢产物，如蛋白多糖、抗生素、微量牛黄酸有抗肿瘤、抗菌消炎、降低血压和防治脑血管障碍等作用，菌多糖和甘露糖有益于调理胃肠作用，以及含有帮助消化的各种酶等。在补气固表、润肤、脱毒排脓、有强身健体、保护肝脏等有较为显著的作用，尤其是在治愈银霄病和其它瘙痒性皮肤病有特殊的功效。另外，北芪菇是一种能产生新型氨基酸的微生物，其丰富的赖氨酸（1.19g/100g）和硒（0.54ppm/100g）可能与吡咯赖氨酸和L-硒代半胱氨酸或L-硒-甲基硒代半胱氨酸的生物合成存在着密切的关系，有望在抑制肿瘤、抗氧化、辅助治疗心血管疾病、解毒排毒等方面进行开发。近年我国对不同植物中的黄芪苷进行了各方面的研究，相继报道了黄芪苷有免疫调节、抗炎，降压，镇静镇痛，保肝护心，清除多种自由基等多方面的药理作用。关于黄芪中黄芪苷的提取及含量测定早有报道，但对产于山西浑源县北芪菇中黄芪苷的含量少有报道，如今北芪菇中黄芪苷的研究备受人们重视，有关黄芪苷的研究变成了科学界的热点。随着社会经济和科学技术的发展，黄芪苷的开发研究和应用范围会更广，开发前景会更好，从而促进医疗事业的发展。北芪菇中的黄芪苷以黄芪皂苷Ⅰ、黄芪皂苷Ⅱ、黄芪皂苷Ⅲ和黄芪甲苷为主。黄芪皂苷Ⅰ、黄芪皂苷Ⅱ、黄芪皂苷Ⅲ在抗氧化、调节免疫功能、保肝、抗病毒和对心脑血管等多方面具有显著作用。黄芪甲苷为环阿尔廷型三萜皂苷类化合物，白色至淡黄色粉末，mp29510~29610e，CAS编号：83207-58-3，分子式为C41H68O14，分子量为784.9702，熔点295.0～296.0℃，易溶于甲醇、乙醇、丙酮，难溶于氯仿、乙酸乙酯等弱极性有机溶剂，生物活性高，是黄芪的主要药理成份，是黄芪及含黄芪制剂的重要鉴定指标。黄芪甲苷对人体拥有非常高的药理作用，其在器官保护（尤其是肝脏、肺、心肌、肾脏、脑等器官）、免疫调节、抗细胞凋亡、抗炎抗病毒、抗糖尿病、清除自由基、抗衰老等方面具有广泛的药理作用。黄芪苷的含量测定与检测曾尝试采用高效液相紫外检测器检测，但由于黄芪苷在紫外区仅有微弱的吸收，溶剂噪音对结果有较大影响，灵敏度低，测定误差大。索氏回流提取需要碱洗及大孔树脂富集过程，洗脱富集复杂，不易操作。此外，还有采用了水浸提法、碱水提取法、回流法、CO2超临界流体萃取法等多种方法，但是这些方法均存在分离纯化量少，精度低，误差大的缺点，无法实现高精度的大量制备。为解决北芪菇中黄芪苷的提取和黄芪皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和黄芪甲苷提取纯化的操作繁琐、结果不可靠的问题，本专利技术提供了一种易于操作、试验耗时短且提取效率高、实现从微克量级的分离分析到克量级的分离制备的北芪菇中黄芪苷提取纯化与检测的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种测定北芪菇中黄芪苷提取纯化和检验的方法，用以克服上述技术缺陷。本专利技术是通过如下技术方案来实现的：一种测定北芪菇中黄芪苷提取纯化和检验的方法，以北芪菇为原料，微波超声波萃取仪辅助处理，采用萃取法对黄芪苷进行粗提取，经薄层层析法分离纯化后，利用质谱和红外质谱检测标准品和供试品，测定旋光度和比旋光度，结晶后测定其熔点，其中，以70%的乙醇为提取剂，料液比为1:25，经微波超声波辅助萃取仪辅助处理后获得黄芪苷粗提取液，以氯仿：甲醇：乙酸乙酯：水的体积比13:7:2:2为展开剂，经薄层层析展开分离纯化黄芪甲苷、黄芪皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，用色谱甲醇和超纯水作为流动相，用质谱仪测定样品分子质量信息（分子离子或碎片离子的质荷比），用红外检测其官能团，并分析其分子结构，利用旋光仪测定旋光度和比旋光度，待溶液蒸发结晶后测定熔点。进一步地，具体过程为：步骤a，以北芪菇为原料，加入70%乙醇，料液比为1:25，振荡浸提，超声波微波萃取仪分三阶段提取，每阶段5min，共15min，超声波频率为50KHz，电机转速900r/min，提取液于4000r/min下离心10min，上清液过滤、浓缩，石油醚去杂后，用饱和正丁醇萃取，合并上层溶液、浓缩至无液体溢出，采用甲醇定容备用；步骤b，将黄芪甲苷、黄芪皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ标准品分别加于色谱甲醇中，超声条件下充分溶解后制得2mg/mL的标准品溶液，置于2～4℃的冰箱中保存备用；步骤c，将层析板加热活化，用微量进样器吸取黄芪苷粗提液及标准品溶液25μL，依次点供试液20μL，标准品溶液2μL、4μL、6μL，以氯仿：甲醇：乙酸乙酯：水的体积比13:7:2:2静置过夜的下相为北芪菇供试品展开剂，密封后，预饱和20min，放入层析缸中上行展开，待展开前沿距层析板顶端1cm处时，取出放入通风口处，均匀喷10%的硫酸乙醇溶液，加热5分钟后取出，用玻璃板覆盖，四周胶布固定，紫外365nm下检视，薄层色谱成像系统拍照，并标志；步骤d，用色谱甲醇和超纯水作为流动相，用微量进样器吸取10μL的标准品溶液，进样，对谱图进行分析、保存；将供试品层析板置于TLC-质谱接口上，使激光对准圈出的待测斑点中心处，取样，对谱图进行分析、保存；步骤e，打开傅里叶红外光谱仪，测试背景，用毛细管吸取标准品溶液于点样中心处，测试样品，对红外谱图进行处理分析，轻刮层析板上的待测斑点置于烧杯中，加入色谱甲醇，过滤取滤液，制得待测液，待测液的红外检测方法与标准品的检测相同；步骤f，校正旋光仪，分别倒入标准品、待测液，调节模式，测定旋光度和比旋光度，记录数据；步骤g，将待测液蒸发结晶后测定其熔点。与现有技术相比较本专利技术的有益效果在于：微波联合超声波提取比单一的超声波、微波提取效率更高，该方法不仅能使细胞内的目标物质充分溶解于提取剂中，不造成目标物质的损失，而且操作简单、用时短，大大的提高了提取效率，广泛的适用于各种物质的提取。薄层层析能实现对黄芪苷的分离纯化，使得黄芪甲苷、黄芪皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ准确分离，MS和IR联用对其质荷比和所含官能团进行表征与分析，准确度高。TLC-MS-IR联用能实现从微克量级的分离分析到克量级的分离制备，可用于天然产物粗提物的去除杂质和单个产物的精制，适用于从北芪菇中进行物质的制备分离。附图说明图1为本专利技术的含量测定的流程图。图2为黄芪甲苷的结构式。图3为黄芪皂苷Ⅰ标准品的结构式。图4为黄芪皂苷Ⅱ标准品的结构式。图5为黄芪皂苷Ⅲ标准品的结构式。图6为本专利技术的北芪菇供试品与标准品TLC成像图，图中1为黄芪皂苷Ⅰ标准品，2为黄芪皂苷Ⅱ标准品，3为黄芪皂苷Ⅲ标准品，4为黄芪甲苷标准品。图7为本专利技术的正北芪供试品与标准品TLC成像图，图中5为黄芪皂苷Ⅰ标准品，6为黄芪皂苷Ⅱ标准品，7为黄芪皂苷Ⅲ本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种测定北芪菇中黄芪苷含量的方法，其特征在于，以北芪菇为原料，微波超声波萃取仪辅助处理，采用萃取法对黄芪苷进行粗提取，经薄层层析法分离纯化后，利用质谱和红外质谱检测标准品和供试品，测定旋光度和比旋光度，结晶后测定其熔点，其中，以70%的乙醇为提取剂，料液比为1:25，经微波超声波辅助萃取仪辅助处理后获得黄芪苷粗提取液，以氯仿：甲醇：乙酸乙酯：水的体积比13:7:2:2为展开剂，经薄层层析展开分离纯化黄芪甲苷、黄芪皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，用色谱甲醇和超纯水作为流动相，用质谱仪测定样品分子质量信息，用红外检测其官能团，并分析其分子结构，利用旋光仪测定旋光度和比旋光度，待溶液蒸发结晶后测定熔点。

【技术特征摘要】
1.一种测定北芪菇中黄芪苷含量的方法，其特征在于，以北芪菇为原料，微波超声波萃取仪辅助处理，采用萃取法对黄芪苷进行粗提取，经薄层层析法分离纯化后，利用质谱和红外质谱检测标准品和供试品，测定旋光度和比旋光度，结晶后测定其熔点，其中，以70%的乙醇为提取剂，料液比为1:25，经微波超声波辅助萃取仪辅助处理后获得黄芪苷粗提取液，以氯仿：甲醇：乙酸乙酯：水的体积比13:7:2:2为展开剂，经薄层层析展开分离纯化黄芪甲苷、黄芪皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，用色谱甲醇和超纯水作为流动相，用质谱仪测定样品分子质量信息，用红外检测其官能团，并分析其分子结构，利用旋光仪测定旋光度和比旋光度，待溶液蒸发结晶后测定熔点。2.根据权利要求1所述的一种测定北芪菇中黄芪苷含量的方法，其特征在于，该具体过程为：步骤a，以北芪菇为原料，加入70%乙醇，料液比为1:25，振荡浸提，超声波微波萃取仪分三阶段提取，每阶段5min，共15min，超声波频率为50KHz，电机转速900r/min，提取液于4000r/min下离心10min，上清液过滤、浓缩，石油醚去杂后，用饱和正丁醇萃取，合并上层溶液、浓缩至无液体溢出，采用甲醇定容备用；步骤b，将黄芪甲苷、黄芪皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ标准品分别加于色谱甲醇中，超声...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨卫民，秦永其，杜京旗，张利军，赵青红，
申请(专利权)人：吕梁学院，
类型：发明
国别省市：山西,14