禽流感分型的可视化芯片制造技术

本发明专利技术提供了一组禽流感分型检测探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1‑8所示；H5亚型探针的序列如SEQ ID NO.1所示，H7亚型探针的序列如SEQ ID NO.2所示，H9亚型探针的序列如SEQ ID NO.3所示，N1亚型探针的序列如SEQ ID NO.4所示，N9亚型探针的序列如SEQ ID NO.5所示，N2亚型探针的序列如SEQ ID NO.6所示；禽流感病毒NP基因探针的序列如SEQ ID NO.7所示；λ定位基因探针的序列如SEQ ID NO.8所示。

Visual chip for avian influenza typing

The invention provides a set of avian influenza typing detection probes, whose nucleotide sequence is shown as SEQ ID NO.1 8; H5 subtype probe sequence is shown as SEQ ID NO.1; H7 subtype probe sequence is shown as SEQ ID NO.2; H9 subtype probe sequence is shown as SEQ ID NO.3; N1 subtype probe sequence is shown as SEQ ID NO.4; N9 subtype probe sequence is shown as SEQ ID NO.5; N2 subtype probe sequence is shown as SEQ ID NO.2. The sequence of the probe is shown in SEQ ID NO.6; the sequence of NP gene probe of avian influenza virus is shown in SEQ ID NO.7; and the sequence of lambda location gene probe is shown in SEQ ID NO.8.

【技术实现步骤摘要】
禽流感分型的可视化芯片
本专利技术涉及病毒检测领域，特别涉及禽流感分型的可视化芯片检测。
技术介绍
禽流感是由正粘病毒科A型流感病毒引起的综合性病症，高致病性禽流感可导致100％的发病率和死亡率，危害人和家禽健康的烈性传染病。禽流感病毒(AvianInfluenzaVirus，AIV)的NP蛋白结构高度保守，可作为AIV分类及区别于其他病原的基础。禽流感病毒血清型的类型较多，其中血凝素(HA)亚型有16种，神经氨酸酶(NA)亚型有9种类型。亚型的类别不仅较多，同时其核酸的8个基因组片段可以随机互换，引起毒株出现重组多样性，导致出现新的禽流感病毒毒株，并且不断地发生变异，给疾病诊断带来了一定困扰。传统的RT-PCR技术常用于禽流感病毒亚型的检测。Leijon等人利用实时荧光定量RT-PCR方法来达到区别禽流感病毒不同亚型的目的。研究者们将限制性内切酶运用于RT-PCR技术中，将RT-PCR产物经过不同的限制性内切酶处理后达到区别禽流感亚型的目的。由于限制性内切酶数量有限，因此该方法的缺点为不能对多种亚型进行同时区别。因此，面对禽流感病毒的不断变异现象，急需建立一种快速、低成本、容易操作且结果敏感性强、特异性好的检测方法。基因芯片技术因其能同时检测成百上千种基因被广泛地应用于病毒的分型检测中。早期的文献已有利用基因芯片对禽流感病毒进行分型的报道，但其检测结果需要依赖昂贵的荧光扫描仪观察结果，因此限制了基因芯片在临床中的广泛使用。金标银染显色的可视化芯片通过生物素和链酶亲和素特异性结合，引入纳米金，利用纳米金催化的氧化还原反应，形成肉眼可见的黑色银染信号。其脱离昂贵的荧光扫描仪，且具有操作简单、灵敏度高等特点，目前已经广泛应用于基因突变分析、疾病诊断、药物筛选等方面。然而，至今尚未见金标银染显色的可视化芯片用于禽流感分型的检测。
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术提供了一种禽流感分型的可视化芯片，可对禽流感H5、H7、H9、N1、N9和N2六种亚型进行可视化检测。本专利技术提供了一组禽流感分型检测探针，其特征在于：其核苷酸序列如SEQIDNO.1-8所示；H5亚型探针的序列如SEQIDNO.1所示，H7亚型探针的序列如SEQIDNO.2所示，H9亚型探针的序列如SEQIDNO.3所示，N1亚型探针的序列如SEQIDNO.4所示，N9亚型探针的序列如SEQIDNO.5所示，N2亚型探针的序列如SEQIDNO.6所示；禽流感病毒NP基因探针的序列如SEQIDNO.7所示；λ定位基因探针的序列如SEQIDNO.8所示。前述探针，其特征在于：5’端连接了一个氨基。本专利技术还提供了一组PCR引物，其特征在于：其核苷酸序列如SEQIDNO.9-24所示；H5亚型引物的序列如SEQIDNO.9-10所示，H7亚型引物的序列如SEQIDNO.11-12所示，H9亚型引物的序列如SEQIDNO.13-14所示，N1亚型引物的序列如SEQIDNO.15-16所示，N9亚型引物的序列如SEQIDNO.17-18所示，N2亚型引物的序列如SEQIDNO.19-20所示；禽流感病毒NP基因引物的序列如SEQIDNO.21-22所示；λ定位基因引物的序列如SEQIDNO.23-24所示。前述引物，其特征在于：下游引物的5’端带有生物素标记。本专利技术还提供了一种检测禽病毒的可视化基因芯片，其特征在于：包含基质膜和前述禽病毒检测探针。前述的基因芯片，其特征在于，所述基质膜为醛基修饰的硅晶片或玻璃。本专利技术还提供了前述芯片的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)设计探针位置的阵列；(2)稀释寡核苷酸探针；(3)使用芯片点样系统按照步骤(1)中的阵列对基质膜点上对应的步骤(2)的探针，在芯片背面用记号笔沿着探针阵列画框；(4)紫外交联6～12min，37℃水合过夜；(5)使用封闭液进行封闭，然后清洗晾干、置于4℃保存备用。前述的方法，其特征在于：步骤(5)所述的封闭液包含：0.2％-1％的BH4Na和20％-30％的乙醇。本专利技术还提供了一种可以检测禽病毒的可视化检测方法，其特征在于：它是使用前述芯片实现的。前述的检测方法，其特征在于：包括如下步骤：A)DNA扩增：将样本DNA使用前述引物扩增，扩增后将产物混匀；B)杂交：将A)中混合产物高温变性5分钟，立即冰浴3min，滴加到含围栏固定的芯片阵列区域，静置，超纯水冲洗，室温下晾干；C)孵育：在芯片阵列区域加入Nanogold-Streptavidin链霉亲和素溶液在37℃孵育30min，超纯水冲洗，室温下晾干；D)银染：避光加入银染试剂，静置，超纯水清洗，自然晾干；E)判读：对应探针区域出现黑点，即可判定为检测阳性；优选地，步骤B)的静置温度是35-55℃，静置温度为60-150min；优选地，步骤C)的Nanogold-Streptavidin链霉亲和素溶液浓度是1-10μg/mL；优选地，步骤D)的静置时间是3-9min。本专利技术的技术方案是目前已公开技术中，首先使用金标银染可视化芯片对禽流感病毒分型的技术方案。其借助银离子在纳米金颗粒表面的还原显色，可以直接肉眼判读检测结果，不需要传统芯片所必需的荧光扫描仪，使用方便，成本低廉。本专利技术因为利用链霉素和纳米金颗粒对杂交信号级联放大，能达到的最低检测浓度是1pg/μl；由于探针设计合理，本专利技术所涉及6种禽流感病毒亚型及探针不会出现肉眼可见的非特异杂交。本专利技术能够区分6种常见禽流感病毒亚型，具有广阔的应用前景。附图说明图1为芯片上探针的位置图。图2为靶基因鉴定电泳图：M：2000bpDNALadder；1：λ定位基因；2：AIV-NP；3：H5-HA；4：H7-HA；5：H9-HA；6：N1-NA；7：N9-NA；8：N2-NA；9：阴性对照。图3为引物特异性检测电泳图：A-F：H5，H7，H9，N1，N9，N2引物扩增结果；M：D2000marker；1-3：H5N6，H7N9，H9N2的cDNA扩增结果；N：阴性对照。图4为共有基因(1ambda定位基因和禽流感NP基因)的测定图。图5为H5、H7、H9、N1、N9和N2六种亚型的共检图。图6为H5、H7、H9、N1、N9、N2亚型可视化基因芯片特异性试验结果：A：H5；B：H7；C：H9；D：N1；E：N9；F：N2。图7为H5、H7、H9、N1、N9、N2亚型可视化基因芯片特异性试验结果：A：ALV；B：MDV；C：IBDV；D：NDV；E：IBV；F：ILTV。图8为H5、H7、H9、N1、N9、N2亚型可视化基因芯片特异性试验结果：A：H5N6毒株；B：H7N9毒株；C：H9N2毒株。图9为H5N1亚型RT-PCR的敏感性试验结果：A：H5亚型；B：N1亚型1～8：禽流感H5N1亚型模板10-1到10-8浓度倍比稀释；N：阴性对照；M：2000bpDNALadder。图10为H5N1亚型可视化基因芯片的敏感性试验结果：A：1×10-1ng\ul；B：1×10-3ng\ul；C：1×10-5ng\ul；D：1×10-7ng\ul；E：1×10-9ng\ulF：1×10-10ng\ulG：1×10-11ng\ul。图11为H7N9亚型RT-PCR的敏感性试验结果：A：H7亚型；B：N9本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一组禽流感分型检测探针，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO.1‑8所示；H5亚型探针的序列如SEQ ID NO.1所示，H7亚型探针的序列如SEQ ID NO.2所示，H9亚型探针的序列如SEQ ID NO.3所示，N1亚型探针的序列如SEQ ID NO.4所示，N9亚型探针的序列如SEQ ID NO.5所示，N2亚型探针的序列如SEQ ID NO.6所示；禽流感病毒NP基因探针的序列如SEQ ID NO.7所示；λ定位基因探针的序列如SEQ ID NO.8所示。

【技术特征摘要】
1.一组禽流感分型检测探针，其特征在于：其核苷酸序列如SEQIDNO.1-8所示；H5亚型探针的序列如SEQIDNO.1所示，H7亚型探针的序列如SEQIDNO.2所示，H9亚型探针的序列如SEQIDNO.3所示，N1亚型探针的序列如SEQIDNO.4所示，N9亚型探针的序列如SEQIDNO.5所示，N2亚型探针的序列如SEQIDNO.6所示；禽流感病毒NP基因探针的序列如SEQIDNO.7所示；λ定位基因探针的序列如SEQIDNO.8所示。2.根据权利要求1所述探针，其特征在于：5’端连接了一个氨基。3.一组PCR引物，其特征在于：其核苷酸序列如SEQIDNO.9-24所示；H5亚型引物的序列如SEQIDNO.9-10所示，H7亚型引物的序列如SEQIDNO.11-12所示，H9亚型引物的序列如SEQIDNO.13-14所示，N1亚型引物的序列如SEQIDNO.15-16所示，N9亚型引物的序列如SEQIDNO.17-18所示，N2亚型引物的序列如SEQIDNO.19-20所示；禽流感病毒NP基因引物的序列如SEQIDNO.21-22所示；λ定位基因引物的序列如SEQIDNO.23-24所示。4.根据权利要求3所述引物，其特征在于：下游引物的5’端带有生物素标记。5.一种检测禽病毒的可视化基因芯片，其特征在于：包含基质膜和权利要求1所述禽病毒检测探针。6.根据权利要求5所述的基因芯片，其特征在于，所述基质膜为醛基修饰的硅晶片或玻璃。...

【专利技术属性】
技术研发人员：文翼平，向华，文心田，杨国淋，黄小波，曹三杰，伍锐，赵勤，
申请(专利权)人：四川农业大学，
类型：发明
国别省市：四川,51