一种基于三重荧光PCR法联合检测版纳病毒、卡地皮诺病毒及辽宁病毒的引物探针组及试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种三重荧光PCR法联合检测版纳病毒、卡地皮诺病毒及辽宁病毒的引物探针组，包括针对版纳病毒的特异性引物及探针、针对卡地皮诺的探针及引物、针对辽宁病毒的探针及引物，针对版纳病毒的正向引物序列如SEQ ID No.1所示，针对版纳病毒的反向引物序列如SEQ ID No.2所示，针对卡地皮诺的正向引物序列如SEQ ID No.3所示，针对卡地皮诺的反向引物序列如SEQ ID No.4所示；针对辽宁病毒的正向引物序列如SEQ ID No.5所示，针对辽宁病毒的反向引物序列如SEQ ID No.6所示。本发明专利技术引物探针组及试剂盒可以对版纳病毒、卡地皮诺病毒及辽宁病毒进行检测，检测灵敏度达1×10

A primer probe group and kit for detection of Banna virus, Carpinovirus and Liaoning virus based on triple fluorescent PCR

The invention discloses a primer probe group for combined detection of Banna virus, Carpinovirus and Liaoning virus by triple fluorescent PCR, including specific primers and probes for Banna virus, probes and primers for Carpino, probes and primers for Liaoning virus, and positive primer sequences for Banna virus as shown in SEQ ID No.1, and reverse primers for Banna virus. As shown in SEQ ID No.2, the sequence of positive primers for Cardipinol is shown in SEQ ID No.3, the sequence of reverse primers for Cardipinol is shown in SEQ ID No.4, the sequence of positive primers for Liaoning virus is shown in SEQ ID No.5 and the sequence of reverse primers for Liaoning virus is shown in SEQ ID No.6. The primer probe group and kit of the invention can detect Banna virus, Carpinovirus and Liaoning virus, and the detection sensitivity is 1 X 10.

【技术实现步骤摘要】
一种基于三重荧光PCR法联合检测版纳病毒、卡地皮诺病毒及辽宁病毒的引物探针组及试剂盒
本专利技术涉及一种联合检测版纳病毒、卡地皮诺病毒及辽宁病毒的引物探针组及试剂盒，特别是涉及一种基于三重荧光PCR法联合检测版纳病毒、卡地皮诺病毒及辽宁病毒的引物探针组、试剂盒及其使用方法。
技术介绍
版纳病毒(Bannavirus，BAV)为呼肠科(thefamilyReoviridae)，东南亚十二节段RNA病毒属(thegenusSeadornavirus)病毒。基因组包含12个节段双链病毒RNA,是一种主要经蚊虫传播种虫媒病毒。版纳病毒在云南省西双版纳地区首次分离并命名为版纳病毒，目前该病毒主要分布在中国、越南和印度尼西亚。版纳病毒可感染人及其它脊椎动物，无宿主特异性，可引起人类脑炎的症状。已有的研究发现中国的部分地区脑炎病例中存在版纳病毒特异性抗体，因而版纳病毒可能已经成为我国病毒性脑炎的重要病原体之一，后续的虫病病毒调查研究发现，版纳病毒也存在于北京、海南、贵州、新疆、河南、云南等地采集的蚊虫标本中，因而版纳病毒的流行范围比我们预计的要更加广泛。卡地皮诺病毒(Kadipirovirus，KDV)同属呼肠科(thefamilyReoviridae)，东南亚十二节段RNA病毒属(thegenusSeadornavirus)的病毒，1981年首次在印度尼西亚的棕头库蚊(Culexfuscocephalus)中用C6/36细胞系分离出，首次鉴定为呼肠科(thefamilyReoviridae)的杯状病毒属(thegenusColtivirus)，后被重新分类入东南亚十二节段RNA病毒属(thegenusSeadornavirus)。随后在我国云南的三带喙库蚊(Culextritaeniorhynchus)、中华按蚊(Anophelessinensis)、骚扰阿蚊(Armigeressubalbatus)，山东的中华按蚊(Anophelessinensis)中也分离出卡地皮诺病毒，显示该病毒具有广泛的地域分布。辽宁病毒(Liaoningvirus，LNV)是呼肠科(thefamilyReoviridae)，东南亚十二节段RNA病毒属(thegenusSeadornavirus)的第三个种。首次在中国辽宁的背点伊蚊(Aedesdorsalis)中分离到，是东南亚十二节段病毒属中唯一可在哺乳动物细胞上复制的种。虽然目前未有辽宁病毒感染人的病例报道，但是这种病毒寄生的背点伊蚊广泛存在于北美、欧洲和亚洲地区，是一些森林哺乳动物及鸟类的食物，是北美西尼罗病毒(WestNilevirus)及西方马脑炎病毒(Westernequineencephalitisvirus)的主要传播媒介，因而具有潜在爆发的危险。最近在我国的新疆及东北的其它地区的背点蚊媒中也分离到了辽宁病毒，且病毒具有较高的进化速率，因而辽宁病毒带来的威胁与日俱增。版纳病毒、辽宁病毒及卡地皮诺病毒同属呼肠科(thefamilyReoviridae)，东南亚十二节段RNA病毒属(thegenusSeadornavirus)的病毒，遗传结构相似，传播媒介均为蚊媒，流行区域均集中在中国的及与中国有密切人员及贸易交流的国家，一旦引起人的感染爆发，三者的的鉴别需依赖于实验室特异性检测，但目前并无同时针对上述三种病毒的特异性检测试剂盒。
技术实现思路
本专利技术提供了一种基于三重荧光PCR法联合检测版纳病毒、卡地皮诺病毒及辽宁病毒的引物探针组、试剂盒及其使用方法，以解决缺少对版纳病毒、卡地皮诺病毒及辽宁病毒进行有效检测方法的问题。本专利技术公开了一种三重荧光PCR法联合检测版纳病毒、卡地皮诺病毒及辽宁病毒的引物探针组，包括针对版纳病毒的特异性引物及探针、针对卡地皮诺的探针及引物、针对辽宁病毒的探针及引物，所述针对版纳病毒的特异性引物包括正向引物和反向引物，针对版纳病毒的正向引物的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，针对版纳病毒的反向引物的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示，所述针对卡地皮诺的特异性引物包括正向引物和反向引物，针对卡地皮诺的正向引物的核苷酸序列如SEQIDNo.3所示，针对卡地皮诺的反向引物的核苷酸序列如SEQIDNo.4所示；所述针对辽宁病毒的特异性引物包括正向引物和反向引物，针对辽宁病毒的正向引物的核苷酸序列如SEQIDNo.5所示，针对辽宁病毒的反向引物的核苷酸序列如SEQIDNo.6所示。进一步地，所述版纳病毒探针的探针序列如SEQIDNo.7所示。所述针对卡地皮诺的探针序列如SEQIDNo.8所示。所述针对辽宁病毒的探针序列如SEQIDNo.9所示。进一步地，所述版纳病毒探针、卡地皮诺探针、辽宁病毒探针两端标记有荧光报告基团和荧光淬灭基团。更进一步地，所述版纳病毒探针5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团；所述卡地皮诺探针5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团；所述辽宁病毒探针5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。具体可选用的荧光报告基团包括但不限于FAM、HEX、CY5等中的一种或多种的组合。在本专利技术一实施例中，所述版纳病毒探针荧光报告基团为FAM荧光基团，所述卡地皮诺探针荧光报告基团为HEX荧光基团，所述辽宁病毒探针的荧光报告基团为CY5荧光基团，所述版纳病毒探针、卡地皮诺探针、辽宁病毒探针的荧光淬灭基团均为BHQ1。更进一步地，所述版纳病毒探针上标记的荧光报告基团、所述卡地皮诺探针上标记的荧光报告基团、所述辽宁病毒探针上标记的荧光报告基团的荧光波长不相同。本专利技术所提供的试剂盒中，版纳病毒、卡地皮诺病毒和辽宁病毒探针上标记的荧光报告基团不相同且荧光波长不相同，优选情况下，三种荧光报告基团的荧光波长相差较大、信号强度相近，保证了检测结果的准确性，避免了信号之间的相互干扰。本专利技术还公开了一种三重荧光定量PCR检测版纳病毒、卡地皮诺及辽宁病毒的试剂盒，所述试剂盒包括上述引物探针组。进一步地，所述试剂盒还包括PCR试剂和阳性对照中的一种或多种。本专利技术所提供的试剂盒用于版纳病毒、卡地皮诺病毒及辽宁病毒的荧光PCR检测，所以试剂盒中还可以包括其他荧光PCR检测中的相关试剂，具体包括但不限于：PCR试剂、阴性对照品和阳性对照品等。所述RNA抽提试剂可使用本领域各种病毒RNA抽提试剂，这些试剂均可通过市售途径获得。所述PCR试剂可采用本领域各种PCR试剂，具体可包括PCR预混液、PCR酶(包括反转录酶和Taq酶)、工艺用水等，所述工艺用水包括但不限于ddH2O，这些试剂均可通过市售途径获得。本领域技术人员可根据实际需要确定阴性对照品和阳性对照品，在本专利技术一实施例中，所述阴性对照品为DEPC-H2O，所述阳性对照品为含有版纳病毒、卡地皮诺病毒及辽宁病毒扩增序列的质粒。本专利技术所提供的三重检测版纳病毒、卡地皮诺病毒及辽宁病毒的试剂盒采用Taqman荧光定量PCR原理，分别针对版纳病毒、卡地皮诺病毒及辽宁病毒设计特异性引物，扩增特异性核酸序列，同时分别设计Taqman探针，并标记不同的荧光报告基团，位于上下游引物之间。探针其5’端标记荧光报告基团，3’端标记非荧光淬灭基团。当探针完整的时候，报告基团所发射的荧光能量被淬灭基团吸收，仪器检测不本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于三重荧光定量PCR检测版纳病毒、卡地皮诺病毒及辽宁病毒的引物探针组，所述引物探针组包括针对版纳病毒的特异性引物、版纳病毒探针、针对卡地皮诺的特异性引物、卡地皮诺探针、针对辽宁病毒的特异性引物及辽宁病毒探针，所述针对版纳病毒的特异性引物包括正向引物和反向引物，所述针对巴泰的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述针对巴泰的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，所述针对卡地皮诺的特异性引物包括正向引物和反向引物，所述针对卡地皮诺的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；所述针对卡地皮诺的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；所述针对辽宁病毒的特异性引物包括正向引物和反向引物，针对辽宁病毒的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，针对辽宁病毒的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。

【技术特征摘要】
1.一种基于三重荧光定量PCR检测版纳病毒、卡地皮诺病毒及辽宁病毒的引物探针组，所述引物探针组包括针对版纳病毒的特异性引物、版纳病毒探针、针对卡地皮诺的特异性引物、卡地皮诺探针、针对辽宁病毒的特异性引物及辽宁病毒探针，所述针对版纳病毒的特异性引物包括正向引物和反向引物，所述针对巴泰的正向引物的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，所述针对巴泰的反向引物的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示，所述针对卡地皮诺的特异性引物包括正向引物和反向引物，所述针对卡地皮诺的正向引物的核苷酸序列如SEQIDNo.3所示；所述针对卡地皮诺的反向引物的核苷酸序列如SEQIDNo.4所示；所述针对辽宁病毒的特异性引物包括正向引物和反向引物，针对辽宁病毒的正向引物的核苷酸序列如SEQIDNo.5所示，针对辽宁病毒的反向引物的核苷酸序列如SEQIDNo.6所示。2.如权利要求1所述的引物探针组，其特征在于，所述版纳病毒探针的探针序列如SEQIDNo.7所示。3.如权利要求1或2所述的引物探针组，其特征在于，所述针对卡地皮诺的探针序列如SEQIDNo.8所示。4.如权利要求1所述的引物探针组，其特征在于，所述针对辽宁病毒的探针序列如SEQIDNo.9所示。5.如权利要求1所述的引物探针组，其特征在于，所述版纳病毒探针、卡地皮诺探针、辽宁病毒探针两端标记有荧光报告基团和荧光淬灭基团。6.如权利要求5所述的引物探针组，其特征在于，所述版纳病毒探针5’端标记有荧光报告基团，3...

【专利技术属性】
技术研发人员：张欢，孙九峰，谈琦琪，梁楚敏，张欣，周惠琼，张鲍欢，宁丹，吴德，
申请(专利权)人：广东省疾病预防控制中心，广东省公共卫生研究院，
类型：发明
国别省市：广东,44