本发明专利技术公开了一种快速检测禽腺病毒‑I群的PCR方法。本发明专利技术采用免提核酸法获得核酸进行PCR扩增，与现有技术相比，无需对样品进行繁琐处理，明显缩短检测时间；获得核酸的浓度高出4‑14倍，且不影响核酸纯度；对同一样品检测，其敏感性高出4倍和10倍。免提核酸PCR方法用时短、特异性强、敏感性高、稳定性好，能快速、敏感和特异性地对禽腺病毒‑I群进行检测。
A Rapid PCR Method for Detecting Avian Adenovirus-I Group
The invention discloses a PCR method for rapid detection of avian adenovirus group I. Compared with the existing technology, the method of extract-free nucleic acid is used to obtain nucleic acid for PCR amplification, and the detection time is obviously shortened, the concentration of nucleic acid obtained is 4_14 times higher, and the purity of nucleic acid is not affected, and the sensitivity of the same sample detection is 4 times and 10 times higher. The method of DNA-free PCR has the advantages of short time, high specificity, high sensitivity and stability, and can detect avian adenovirus group I rapidly, sensitively and specifically.
【技术实现步骤摘要】
一种快速检测禽腺病毒-I群的PCR方法
本专利技术涉及一种快速检测禽腺病毒-I群的PCR方法。
技术介绍
禽腺病毒属于腺病毒科禽腺病毒属，根据其抗原性不同可分为3个群；根据血清交叉中和反应性，禽腺病毒-I群可分为12个血清型(血清型1-7、8a、8b、9-11)。禽腺病毒-I群在世界范围内广泛分布，近年来研究报道，禽腺病毒-I群不同血清型毒株感染引起的鸡肝炎-心包积液综合征、包涵体肝炎等在我国广泛流行，尤其是血清4型禽腺病毒引起的鸡肝炎-心包积液综合征造成肉鸡大量死亡，给我国养鸡业造成了严重的经济损失。为有效控制禽腺病毒-I群的感染，需建立快速、准确的诊断方法。禽腺病毒-I群的诊断方法包括传统的病原分离鉴定、血清学方法和分子生物学技术。最初通过病理组织学观察肝细胞的核内包涵体和电镜观察病毒粒子形态进行禽腺病毒-I群感染的诊断，随后应用鸡胚、鸡胚肾细胞、鸡胚肝细胞、Vero细胞等进行病毒分离，但这些诊断方法耗时较长，不便于临床疾病的诊断。之后应用琼脂凝胶沉淀试验、间接血凝试验、斑点免疫结合试验、酶联免疫吸附试验、免疫过氧化物酶试验、组织培养和鸡胚培养的病毒中和试验等血清学方法检测抗体进行诊断，但被感染鸡和免疫鸡体内都存在抗体，检测结果很难进行解释。分子生物学技术对禽腺病毒-I群进行检测，而非检测抗体，在病毒感染早期即可进行诊断，针对禽腺病毒-I群Hexon基因进行PCR诊断具有较高的敏感性和特异性，此外，通过PCR扩增的Hexon基因可作为斑点杂交用探针、扩增的Hexon通过限制性内切酶酶切后进行限制性片段长度多态性分析可对禽腺病毒-I群血清分型。故，目前PCR诊断方法是检测禽腺病毒-I群感染的敏感和特异性的诊断方法，但PCR方法步骤较多、耗时较长，如何在原有PCR基础上缩短时间提高效率是目前快速诊断所所要解决的问题。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种快速检测禽腺病毒-I群的PCR方法。本专利技术首先提供了一种获得病毒核酸的方法，包括如下步骤：将样本经Buffer处理后，得到病毒核酸；所述Buffer为含有45-50mMTris-HCl、5.8-6.0M尿素和1ml/100ml吐温20的水溶液。所述Buffer具体可为含有50mMTris-HCl、6M尿素和1ml/100ml吐温20的水溶液。所述处理方法为：将样本与所述Buffer混合后98℃静置反应8-10min，然后4℃静置反应10-15min。所述处理方法具体可为：将样本与所述Buffer混合后98℃静置反应8min，然后4℃静置反应15min。所述Buffer与样本等体积混合。当待测样本为组织时，将组织研磨后离心取上清。本专利技术还保护一种检测禽腺病毒-I群的方法，包括如下步骤：(1)采用以上任一所述的方法获得待测病毒或待测样本的病毒核酸；(2)检测步骤(1)得到的病毒核酸中是否存在禽腺病毒-I群的特异片段，如果所述病毒核酸中存在禽腺病毒-I群的特异片段，则待测病毒为I群禽腺病毒或所述待测样本中存在禽腺病毒-I群。所述“检测步骤(1)得到的病毒核酸中是否存在禽腺病毒-I群的特异片段”的方法为：采用特异引物对对步骤(1)得到的病毒核酸进行PCR扩增，如果扩增产物中存在850-910bp的特异条带，则所述扩增产物中存在禽腺病毒-I群的特异片段；所述特异引物对由引物F和引物R组成；所述引物F为如下(a1)或(a2)：(a1)序列表的序列1所示的单链DNA分子；(a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子；所述引物R为如下(a3)或(a4)：(a3)序列表的序列2所示的单链DNA分子；(a4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的DNA分子。所述PCR扩增的反应体系具体可为：核酸2μL，10×PCRbufer3μL，25mMMgcl24μL，10mMdNTP2.5μL，上游引物F和下游引物R各0.5μL(25pmol/w)，Taq酶0.5μL，加灭菌超纯水至30μL。所述PCR扩增的反应程序具体可为：94℃5min变性；94℃1min，55℃lmin，72℃90s，30个循环；72℃延伸10min。以上任一所述特异片段具体可如序列表的序列3所示。本专利技术还保护以上任一所述的Buffer在获得病毒核酸中的应用。本专利技术还保护以上任一所述的Buffer在禽腺病毒-I群检测中的应用。本专利技术还保护一种用于检测禽腺病毒-I群的试剂盒，包括以上任一所述的Buffer和特异引物对。以上任一所述待测病毒具体可为禽腺病毒-I群的12株标准血清型毒株(FAV-1、FAV-2、FAV-3、FAV-4、FAV-5、FAV-6、FAV-7、FAV-8、FAV-9、FAV-10、FAV-11、FAV-12)、血清4型禽腺病毒分离株(FAV-QDLX-140421-B)、8a型禽腺病毒分离株(FAV-SDWF-140620-B)、8b型禽腺病毒分离株(FAV-QDLX-111025-B)或11型禽腺病毒分离株(FAV-SDLQ-140704-G)。以上任一所述待测样本具体可为动物组织，例如肝脏组织。与现有技术相比，本专利技术采用免提核酸法获得核酸进行PCR扩增，无需对样品进行繁琐处理，明显缩短检测时间；获得核酸的浓度高出4-14倍，且不影响核酸纯度；对同一样品检测，其敏感性高出4倍和10倍。免提核酸PCR方法用时短、特异性强、敏感性高、稳定性好，能快速、敏感和特异性地对禽腺病毒-I群进行检测。附图说明图1为不同方法提取核酸PCR扩增结果。1：阴性对照；M：Marker；2：传统Trizol提取核酸PCR法；3：免提核酸PCR法；4：Takara试剂盒提取核酸PCR法。图2为免提核酸PCR法检测禽腺病毒-I群的12株标准血清型毒株结果。M：marker；1-12：血清1-12型禽腺病毒。图3为免提核酸PCR方法检测禽腺病毒-I群的特异性。M：Marker；1：血清4型禽腺病毒分离株；2：8a型禽腺病毒分离株；3：8b型禽腺病毒分离株；4：11型禽腺病毒分离株；5：鸡痘病毒；6：新城疫病毒；7：H9N2亚型禽流感病毒；8：鸡传染性贫血病毒；9：传染性染性支气管炎病毒；10：阴性对照。图4为免提核酸PCR法和传统Trizol提取核酸PCR法敏感性检测结果。M：Marker；1-9：免提核酸PCR结果，分别为原毒、稀释10、100、1000、2000、5000、10000、20000、40000倍；10-18：传统Trizol提取核酸PCR结果，分别为原毒、稀释10倍、100、1000、2000、5000、10000、20000、40000倍。图5为Takara试剂盒提取核酸PCR法敏感性检测结果。M：Marker；1-10：原毒、稀释10倍、100、1000、2000、5000、10000、20000、40000、阴性对照。图6为免提核酸PCR法和传统Trizol提取核酸PCR法检测禽腺病毒-I群临床病料结果。A：传统Trizol提取核酸PCR法检测禽腺病毒-I群临床病料结果；B：免提核酸PCR法检测禽腺病毒-I群临床病料结果。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本专利技术，但并不限定本专利技术。下述实施例中本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种获得病毒核酸的方法，包括如下步骤：将样本经Buffer处理后，得到病毒核酸；所述Buffer为含有45‑50mM Tris‑HCl、5.8‑6.0M尿素和1ml/100ml吐温20的水溶液。
【技术特征摘要】
1.一种获得病毒核酸的方法，包括如下步骤：将样本经Buffer处理后，得到病毒核酸；所述Buffer为含有45-50mMTris-HCl、5.8-6.0M尿素和1ml/100ml吐温20的水溶液。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述Buffer为含有50mMTris-HCl、6M尿素和1ml/100ml吐温20的水溶液。3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述处理方法为：将样本与所述Buffer混合后98℃静置反应8-10min，然后4℃静置反应10-15min。4.如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述处理方法为：将样本与所述Buffer混合后98℃静置反应8min，然后4℃静置反应15min。5.一种检测禽腺病毒-I群的方法，包括如下步骤：(1)采用权利要求1至4任一所述的方法获得待测病毒或待测样本的病毒核酸；(2)检测步骤(1)得到的病毒核酸中是否存在禽腺病毒-I群的特异片段，如果所述病毒核酸中存在禽腺病毒-I群的特异片段，则待测病毒为禽腺病毒-I群或所述待测样本中存在禽腺病毒-I群。6.如权利要求5所述的方法，其特征在于...
【专利技术属性】
技术研发人员：王建琳，尹燕博，栾庆东，江之瑶，
申请(专利权)人：青岛农业大学，
类型：发明
国别省市：山东,37
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