非洲猪瘟病毒的检测试剂、试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种非洲猪瘟病毒的检测试剂、试剂盒及其应用。所述非洲猪瘟病毒检测试剂包括：引物对，包括序列分别如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2所示的上游引物、下游引物，所述上游引物的5’端标记有第一核酸标记物、下游引物的5’端标记有第二核酸标记物。本发明专利技术提供的检测非洲猪瘟病毒的方法是以标记的特异性引物扩增适当长度的基因片段，能够保证检测的高度特异性，提高了检测结果的准确性；并且本发明专利技术提供的检测方法避免了扩增产物稀释和探针杂交等流程，保持了免疫胶体金试纸条技术直观、快速、方便、成熟、廉价等优点。

Detection reagent*kit and application of African swine fever virus

The invention discloses a detection reagent, kit and application of African swine fever virus. The African swine fever virus detection reagent includes: primer pairs, including upstream and downstream primers shown in sequence such as SEQ ID NO:1 and SEQ ID NO:2, respectively. The 5'end of the upstream primer is marked with the first nucleic acid marker and the 5' end of the downstream primer is marked with the second nucleic acid marker. The method for detecting African classical swine fever virus provided by the invention is to amplify appropriate length gene fragments with labeled specific primers, which can ensure the high specificity of detection and improve the accuracy of detection results; moreover, the detection method provided by the invention avoids the process of dilution of amplified products and probe hybridization, and keeps the immunocolloidal gold strip technology intuitive, fast, convenient and convenient. Mature, cheap and so on.

【技术实现步骤摘要】
非洲猪瘟病毒的检测试剂、试剂盒及其应用
本专利技术特别涉及一种非洲猪瘟病毒的检测试剂、试剂盒及其应用，属于分子生物学盒免疫学

技术介绍
非洲猪瘟(Africanswinefever，ASF)是猪的一种高度接触性传染疾病，病死率可达100％，由非洲猪瘟病毒(ASFV)引起与传播。该病发作非常迅速，不到1个世纪的时间，从非洲开始席卷至近乎整个世界。鉴于该病的严重危害性，世界卫生组织(OIE)将其列为法定报告动物疫病，我国将其列为一类动物疫病。目前，针对ASFV防控，尚无有效的商品化疫苗。2018年8月1日，国家外来动物疫病研究中心在沈阳市沈北区确诊我国首例ASF病例，之后又分别在河南郑州，江苏连云港，黑龙江省佳木斯市和安徽芜湖市、宣城市等地发生非洲猪瘟疫情，加强对对我国ASF的检疫及防控已刻不容缓。ASF通常表现急性病程，病猪往往在出现明显临床症状前就死亡。典型症状主要表现出血热、心跳与呼吸频率加速、呕吐腹泻、眼睑分泌物、远端肢体与胸腹部发红、厌食、精神萎靡等。感染动物会出现多器官病理损伤，主要包括淋巴结、肾、膀胱、脾脏、内脏黏膜出现出血点。上述ASF临床症状和病理同古典猪瘟CSF、猪皮炎与肾病综合征PDNS、蓝耳病PPRS比较类似，通过临床诊断和病理诊断很容易混淆，因此需要快速、可靠、特异、敏感的检测技术辅助诊断。目前为止，ASF尚无有效疫苗预防及治疗方法，短期内依靠早期诊断与区域化防控管理来进行防制。各国均采用严格的监测计划，一经发现采取大范围扑杀方式切断传染源。现有的检测方法存在操作复杂、易受环境影响、容易感染、不适于早期诊断且检测结果误差较大等缺点。因此，亟需一种快速、准确、便捷的诊断方法。
技术实现思路
本专利技术的主要目的在于提供一种非洲猪瘟病毒的检测试剂、试剂盒及其应用，以克服现有技术的不足。为实现前述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案包括：本专利技术实施例一方面提供了一种非洲猪瘟病毒检测试剂，其于包括：引物对，包括序列分别如SEQIDNO：1、SEQIDNO：2所示的上游引物、下游引物，所述上游引物的5’端标记有第一核酸标记物，所述下游引物的5’端标记有第二核酸标记物。进一步的，所述第一核酸标记物和第二核酸标记物为半抗原或荧光素分子标记。优选的，所述的半抗原包括生物素或地高辛；所述荧光素包括罗丹明、异硫氰酸荧光素、Cy3、Cy5中的任意一种，但不限于此。优选的，所述第一核酸标记物和第二核酸标记物不同。本专利技术实施例一方面提供了一种用于检测非洲猪瘟病毒的试剂盒，其包括所述的非洲猪瘟病毒检测试剂。进一步的，所述试剂盒还包括PCR扩增组件。进一步的，所述的试剂盒还包括层析试纸条，所述层析试纸条包括吸水滤纸垫、结合物垫、侧向层析基质以及吸水垫，所述侧向层析基质上形成有检测带和质控带，所述检测带远离吸水垫设置，所述质控带设置于检测带和吸水垫之间，所述吸水滤纸垫、吸水垫分别设置在侧向层析基质的两端，所述结合物垫设置在吸水滤纸垫上，所述结合物垫上附有第一抗体，所述第一抗体为第一核酸标记物或第二核酸标记物的抗体与有色颗粒的复合物，所述检测带包含第二抗体，所述第二抗体为第二核酸标记物或第一核酸标记物的抗体或配体；所述质控带包含第三抗体，所述第三抗体为能够结合指定种属来源抗体的抗体。进一步的，所述侧向层析基质结合在衬底上。优选的，所述的侧向层析基质包括硝酸纤维膜。优选的，所述的第三抗体为羊抗鼠多抗。优选的，所述的有色颗粒为胶体金颗粒。本专利技术实施例还提供了一种检测非洲猪瘟病毒的方法，其包括：提供所述的试剂盒，提取非洲猪瘟病毒的DNA，并利用所述试剂盒中的引物对及PCR扩增组件进行PCR扩增获得扩增产物；将所述扩增产物滴加在所述试剂盒中的层析试纸条的吸水滤纸垫上，并观察质控带、检测带；若在检测带上形成肉眼可见的有色线条，则判断为阳性；否则为阴性。进一步的，所述PCR扩增的反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸1min，扩增35个循环，最后72℃延伸7min。本专利技术实施例另一方面提供了一种产品，应用于非洲猪瘟病毒的检测方法，所述的产品包括所述的试剂盒，并且所述的检测方法包括：提取非洲猪瘟病毒的DNA，并利用所述试剂盒中的引物对及PCR扩增组件进行PCR扩增获得扩增产物，其中采用的PCR扩增反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸1min，扩增35个循环，最后72℃延伸7min；将所述扩增产物滴加在所述试剂盒中的层析试纸条的吸水滤纸垫上，并观察质控带、检测带；若在检测带上形成肉眼可见的有色线条，则判断为阳性；否则为阴性。与现有技术相比，本专利技术提供的检测非洲猪瘟病毒的方法是以标记的特异性引物扩增适当长度的基因片段，能够保证检测的高度特异性，提高了检测结果的准确性；并且本专利技术提供的检测方法避免了扩增产物稀释和探针杂交等流程，保持了免疫胶体金(试纸条)技术直观，具有快速，方便，成熟，廉价等优点；以及PCR扩增方法具有高灵敏度、高特异性的特点。附图说明图1是本专利技术一典型实施案例中一种层析试纸条的结构示意图；图2是本专利技术一典型实施案例中一种层析试纸条检测非洲猪瘟病毒的检测结果示意图；图3为本专利技术实施例1中采用特异性标记引物检测猪瘟病毒PCR-试纸条的特异性检测结果；图4为本专利技术实施例1中采用特异性标记引物检测猪瘟病毒PCR-凝胶电泳的特异性检测结果；图5为本专利技术实施例2中采用特异性标记引物检测猪瘟病毒PCR-凝胶电泳的灵敏度检测结果；图6为本专利技术实施例2中采用特异性标记引物检测猪瘟病毒PCR-试纸条的灵敏度检测结果。具体实施方式鉴于现有技术中的不足，本案专利技术人经长期研究和大量实践，得以提出本专利技术的技术方案。如下将对该技术方案、其实施过程及原理等作进一步的解释说明。若非特别说明，本说明书中所使用的技术术语的释义均是本领域技术人员知悉的，例如：引物：DNA合成的起始物，一般为一对单链寡核苷酸，在与模板杂交后，DNA合成从其3’末端开始。标记：将可检测的信号分子(如半抗原，荧光，放射性等)与单链寡聚核苷酸相偶联的方法。杂交：特指互补的DNA单链通过碱基配对形成双链结构。展开：经扩增反应的PCR产物在展开缓冲液的层析作用下由试纸条吸水垫底端开始向检测线、质控线方向移动的过程。核酸：脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)的通称。抗原和半抗原：具备免疫原性的物质。通常为大分子蛋白质或细胞组分。但有些小分子也具备免疫原性，被称为半抗原(Hapten)。半抗原常被用于标记探针。抗体：能与抗原或半抗原特异性结合的蛋白质分子。复合体：由两种或两种以上分子特异性结成的结合物。引物二聚体：在聚合酶链式反应(PCR)过程中，因引物对间、或单条引物相互退火形成的二聚体分子，由两条不同引物构成的二聚体为异二聚体，因带有两种标记而可能引起与种抗体的结合而造成假阳性，由单一引物退火形成的二聚体为同二聚体，仅带有一种标记而不会引起假阳性，但过多的二聚体形成会降低扩增效率。免疫试纸条：用于快速检测的医学工具。又称为呈色薄膜层析。核酸聚合酶：合成核酸长链的酶类。分为DNA聚合酶和RNA聚合酶两大类。本专利技术实施例一方面提供了一种非洲猪瘟病毒检测试剂，其于包括：引物对本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种非洲猪瘟病毒检测试剂，其特征在于包括：引物对，包括序列分别如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2所示的上游引物、下游引物，所述上游引物的5’端标记有第一核酸标记物，所述下游引物的5’端标记有第二核酸标记物。

【技术特征摘要】
2018.09.29 CN 20181115339911.一种非洲猪瘟病毒检测试剂，其特征在于包括：引物对，包括序列分别如SEQIDNO：1、SEQIDNO：2所示的上游引物、下游引物，所述上游引物的5’端标记有第一核酸标记物，所述下游引物的5’端标记有第二核酸标记物。2.根据权利要求1所述的非洲猪瘟病毒检测试剂，其特征在于：所述第一核酸标记物和第二核酸标记物为半抗原或荧光素分子标记；优选的，所述的半抗原包括生物素或地高辛；所述荧光素包括罗丹明、异硫氰酸荧光素、Cy3、Cy5中的任意一种；优选的，所述第一核酸标记物和第二核酸标记物不同。3.一种用于检测非洲猪瘟病毒的试剂盒，其特征在于包括权利要求1-2中任一项所述的非洲猪瘟病毒检测试剂。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括PCR扩增组件。5.根据权利要求3或4所述的试剂盒，其特征在于还包括层析试纸条，所述层析试纸条包括吸水滤纸垫、结合物垫、侧向层析基质以及吸水垫，所述侧向层析基质上形成有检测带和质控带，所述检测带远离吸水垫设置，所述质控带设置于检测带和吸水垫之间，所述吸水滤纸垫、吸水垫分别设置在侧向层析基质的两端，所述结合物垫设置在吸水滤纸垫上，所述结合物垫上附有第一抗体，所述第一抗体为第一核酸标记物或第二核酸标记物的抗体与有色颗粒的复合物，所述检测带包含第二抗体，所述第二抗体为第二核酸标记物或第一核酸标记物的抗体或配体；所述质控带包含第三抗体，所述第三抗体为能...

【专利技术属性】
技术研发人员：薛峰，吴晓东，戴建君，曾德新，王志亮，苏静，任建鸾，陈伟，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32