一种甲型流感病毒亚型分型检测高通量试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种甲型流感病毒亚型分型检测高通量试剂盒包括微孔板、与微孔板匹配的微孔板盖、可拆卸地设置在微孔板底部的主电磁吸盘、连接有磁珠连接正向引物的羧基磁珠和5’端带荧光标记的反向引物；微孔板包括多个微孔；微孔板盖上设置有与微孔的内径匹配的环形凸起；微孔板与微孔板盖被设置为可放置入PCR仪中，起到代替PCR管和PCR架的作用。本发明专利技术的试剂盒重复性和灵敏度均高，特异性较好，且操作方便，快捷，无需电泳进行检测RT‑PCR结果。

A high throughput kit for subtyping influenza A virus

The invention discloses a high-throughput kit for influenza A virus subtyping detection, which comprises a microporous plate, a microporous plate cap matched with the microporous plate, a main electromagnetic sucker detachably arranged at the bottom of the microporous plate, a carboxyl magnetic bead connected with a magnetic bead positive primer and a 5'reverse primer with a fluorescent label at the end; a microporous plate comprises a plurality of microholes; a microporous plate cap is provided with a microporous inside. Diameter-matched annular bulge; the microporous plate and the microporous plate cover are set up to be placed in the PCR instrument, playing the role of replacing the PCR tube and the PCR frame. The kit of the invention has high repeatability and sensitivity, good specificity, convenient operation and fast speed, and does not need electrophoresis to detect RT_PCR results.

【技术实现步骤摘要】
一种甲型流感病毒亚型分型检测高通量试剂盒
本专利技术属于生物技术检测领域，尤其涉及一种甲型流感病毒亚型分型检测高通量试剂盒。
技术介绍
甲型流感病毒为常见流感病毒，非常容易发生变异，因此有很多甲型流感病毒亚型。这些亚型则被人们称为“禽流感”。甲型流感对人类致病性高，曾多次引起世界性大流行。甲型流感病毒中至今发现能直接感染人的禽流感病毒亚型有：甲型H1N1、H5N1、H7N1、H7N2、H7N3、H7N7、H7N9、H9N2和H10N8。其中H1、H5、H7亚型为高致病性，H1N1、H5N1、H7N9尤为值得关注。因此非常有必要对甲型流感病毒亚型H1N1、H5N1、H7N9进行检测。目前对于这几种亚型上没有很好的检测方法。
技术实现思路
本专利技术的目的就是提供一种能快速、高效检测甲型流感病毒亚型中的H1N1、H5N1、H7N9的试剂盒。具体方案是：一种甲型流感病毒亚型分型检测高通量试剂盒包括微孔板、与所述微孔板匹配的微孔板盖、可拆卸地设置在所述微孔板底部的主电磁吸盘、连接有磁珠连接正向引物的羧基磁珠和5’端带荧光标记的反向引物；所述微孔板包括多个微孔；所述微孔板盖上设置有与所述微孔的内径匹配的环形凸起；所述微孔板与所述微孔板盖被设置为可放置入PCR仪中，起到代替PCR管和PCR架的作用；所述磁珠连接正向引物由5’端的连接分子和3’端的核心引物组成；所述连接分子为-NH2-(CH2)n-，n＝4-8；所述核心引物的序列如SEQIDNO.1到SEQIDNO.3所示；所述5’端带荧光标记的反向引物的序列如SEQIDNO.4到SEQIDNO.6所示；其中，SEQIDNO.1所示的序列和SEQIDNO.4所示的序列来自甲型流感病毒H1N1亚型，SEQIDNO.4所示的序列的5’端的荧光标记是CY5；SEQIDNO.2所示的序列和SEQIDNO.5所示的序列来自甲型流感病毒H5N1亚型，SEQIDNO.5所示的序列的5’端的荧光标记是VIC；SEQIDNO.3所示的序列和SEQIDNO.6所示的序列来自甲型流感病毒H7N9亚型，SEQIDNO.6所示的序列的5’端的荧光标记是FAM。进一步地，所述微孔的孔壁突出于所述微孔与相邻所述微孔之间的第一连接区域以及所述微孔与所述微孔板侧壁之间的第二连接区域。该结构增加了微孔壁的弹性，使得微孔的孔径能在本领域技术人员知悉的范围内发生微小的变化，从而有利于盖紧。即有利于微孔与微孔板盖上的环形凸起伸入微孔板的微孔时，微孔的孔径适应性地撑大，以便盖紧；当环形凸起离开微孔时，微孔的孔径又能适应性地回原。进步一地，还包括辅助引物；所述辅助引物的序列如SEQIDNO.7到SEQIDNO.9所示，其中SEQIDNO.7所示的序列来自甲型流感病毒H1N1亚型；SEQIDNO.8所示的序列来自甲型流感病毒H5N1亚型；SEQIDNO.9所示的序列来自甲型流感病毒H7N9亚型。辅助引物可在扩增初期与荧光标记的反向引物先预扩增出一些DNA片段，以便于连接在磁珠上的正向引物更容易与预扩增的DNA片段退火结合，提高磁珠参与的反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)的效率，提高检测的灵敏度。进一步地，所述5’端带荧光标记的反向引物与所述辅助引物的物质的量的比例为10～20:1。由于5’端带荧光标记的反向引物的量是辅助引物的10到20倍，因此没有与辅助引物搭配进行RT-PCR扩增的5’端带荧光标记的反向引物可以与羧基磁珠上连接的正向引物匹配进行RT-PCR扩增，从而将目的基因连接到羧基磁珠上，避免RT-PCR扩增只发生在反向引物与辅助引物之间。对应地，序列如SEQIDNO.4所示的5’端带荧光标记的反向引物与序列如SEQIDNO.7所示的辅助引物的物质的量的比为10～20:1；序列如SEQIDNO.5所示的5’端带荧光标记的反向引物与序列如SEQIDNO.8所示的辅助引物的物质的量的比为10～20:1；序列如SEQIDNO.6所示的5’端带荧光标记的反向引物与序列如SEQIDNO.9所示的辅助引物的物质的量的比为10～20:1。进一步地，还包括H1N1亚型阳性对照模板、H5N1亚型阳性对照模板和H7N9亚型阳性对照模板；所述H1N1亚型阳性对照模板为带有如SEQIDNO.10所示的质粒；所述H5N1亚型阳性对照模板为带有如SEQIDNO.11所示的质粒；所述H7N9亚型阳性对照模板为带有如SEQIDNO.12所示的质粒。进一步地，还包括RT-PCR试剂，所述RT-PCR试剂来自天根一步RT-PCR试剂盒(QIAGENOnestepRT-PCRKit)。进一步地，所述微孔板盖的顶面可拆卸地设置有辅电磁吸盘。进一步地，还包括盒体和与所述盒体的内壁贴合的支架；所述支架上设置有微孔板槽、微孔板盖槽、主电磁吸盘槽、辅电磁吸盘槽和若干试剂瓶槽。可选地，所述试剂瓶槽的数量是6个，对应地用于放置装盛连接有磁珠连接正向引物的羧基磁珠的试剂瓶、辅助引物的试剂瓶、5’端带荧光标记的反向引物的试剂瓶、H1N1亚型阳性对照模板的试剂瓶、H5N1亚型阳性对照模板的试剂瓶和H7N9亚型阳性对照模板的试剂瓶。其中，连接有磁珠连接正向引物的羧基磁珠的试剂瓶内为等比例(m/m)混合的核心序列如SEQIDNO.1所示的磁珠、核心序列如SEQIDNO.2所示的磁珠和核心序列如SEQIDNO.3所示的磁珠。辅助引物的试剂瓶内为等比例(物质的量之比)混合的3种基因序列，其序列分别如SEQIDNO.7、SEQIDNO.8和SEQIDNO.9所示。5’端带荧光标记的反向引物的试剂瓶内为等比例(物质的量之比)混合的5’端分别标记了CY5、VIC和FAM的3种基因序列，其序列分别如SEQIDNO.4、SEQIDNO.5和SEQIDNO.6所示。进一步地，所述支架上还设置有RT-PCR试剂槽，用于放置RT-PCR试剂。进一步地，微孔包括彼此连通的上混合区和下分选区；下分选区的顶面面积小于下分选区的最大横截面面积。可选地，微孔板的一对互相平行的侧立面上均设置有槽口，用于机器手握持。可选地，下分选区的纵剖面呈梯形或扇形。可选地，下分选区呈顶面小底面大的圆台状。可选地，微孔的孔壁内侧设置有侧壁凸起，使得下分选区的顶面面积小于下分选区的最大横截面面积。可选地，微孔的底部内侧设置有底部凸起，使得下分选区的顶面面积小于下分选区的最大横截面面积。可选地，底部凸起呈T字形、倒L字型或倒梯形。进一步地，每个微孔中包括多个下分选区。本专利技术的甲型流感病毒亚型分型检测高通量试剂盒，能够高通量、快速、灵敏、特异性检测甲型流感病毒样品，对病原性高的甲型流感病毒H1N1、H5N1和H7N9亚型进行核酸分型，具有很重要的应用价值。引物连接在磁珠上比固定在容器底部更有利于提高RT-PCR效率，因为相对于固定引物，磁珠仅在主电磁吸盘通电时产生的磁场作用下处于容器底部，一旦断开主电磁吸盘的电源，磁场消失，磁珠又可以很容易的离开容器底部，因此，磁珠上的引物可以更好的与其他试剂混合。由于不同亚型的病毒对应不同的荧光标记，且生成的RT-PCR产物是结合在磁珠上的，因此可以通过磁性吸附作用将结合在磁珠上的RT-PCR产物与没有发生RT-PCR反应的荧光标记引物分离开，避免其他荧光信号的影响，从而可以采用本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种甲型流感病毒亚型分型检测高通量试剂盒，其特征在于，包括微孔板、与所述微孔板匹配的微孔板盖、可拆卸地设置在所述微孔板底部的主电磁吸盘、连接有磁珠连接正向引物的羧基磁珠和5’端带荧光标记的反向引物；所述微孔板包括多个微孔；所述微孔板盖上设置有与所述微孔的内径匹配的环形凸起；所述微孔板与所述微孔板盖被设置为可放置入PCR仪中，起到代替PCR管和PCR架的作用；所述磁珠连接正向引物由5’端的连接分子和3’端的核心引物组成；所述连接分子为‑NH2‑(CH2)n‑，n＝4‑8；所述核心引物的序列如SEQ ID NO.1到SEQ ID NO.3所示；所述5’端带荧光标记的反向引物的序列如SEQ ID NO.4到SEQ ID NO.6所示；其中，SEQ ID NO.1所示的序列和SEQ ID NO.4所示的序列来自甲型流感病毒H1N1亚型，SEQ ID NO.4所示的序列的5’端的荧光标记是CY5；SEQ ID NO.2所示的序列和SEQ ID NO.5所示的序列来自甲型流感病毒H5N1亚型，SEQ ID NO.5所示的序列的5’端的荧光标记是VIC；SEQ ID NO.3所示的序列和SEQ ID NO.6所示的序列来自甲型流感病毒H7N9亚型，SEQ ID NO.6所示的序列的5’端的荧光标记是FAM。...

【技术特征摘要】
1.一种甲型流感病毒亚型分型检测高通量试剂盒，其特征在于，包括微孔板、与所述微孔板匹配的微孔板盖、可拆卸地设置在所述微孔板底部的主电磁吸盘、连接有磁珠连接正向引物的羧基磁珠和5’端带荧光标记的反向引物；所述微孔板包括多个微孔；所述微孔板盖上设置有与所述微孔的内径匹配的环形凸起；所述微孔板与所述微孔板盖被设置为可放置入PCR仪中，起到代替PCR管和PCR架的作用；所述磁珠连接正向引物由5’端的连接分子和3’端的核心引物组成；所述连接分子为-NH2-(CH2)n-，n＝4-8；所述核心引物的序列如SEQIDNO.1到SEQIDNO.3所示；所述5’端带荧光标记的反向引物的序列如SEQIDNO.4到SEQIDNO.6所示；其中，SEQIDNO.1所示的序列和SEQIDNO.4所示的序列来自甲型流感病毒H1N1亚型，SEQIDNO.4所示的序列的5’端的荧光标记是CY5；SEQIDNO.2所示的序列和SEQIDNO.5所示的序列来自甲型流感病毒H5N1亚型，SEQIDNO.5所示的序列的5’端的荧光标记是VIC；SEQIDNO.3所示的序列和SEQIDNO.6所示的序列来自甲型流感病毒H7N9亚型，SEQIDNO.6所示的序列的5’端的荧光标记是FAM。2.如权利要求1所述的甲型流感病毒亚型分型检测高通量试剂盒，其特征在于，还包括辅助引物；所述辅助引物的序列如SEQIDNO.7到SEQIDNO.9所示，其中SEQIDNO.7所示的序列来自甲型流感病毒H1N1亚型；SEQIDNO.8所示的序列来自甲型流感病毒H5N1亚型；SEQIDNO.9所示的序列来自甲型流感病毒H7N9亚型。3.如权利要求1所述的甲型流感病毒亚型分型检测高通量试剂盒，其特征在于，所述5’端带荧光标记的反向引物与所述辅助引物的物质的量的比例为10～20:1。4.如权利要求1所述的甲型流感病毒亚型分型检测高通量试剂盒，其特征在于，还包括H1N1亚型阳性对照模板、H5N1亚型阳性对照模板和H7N9亚型阳性对照模板；所述H1N1亚型阳性对照模板为带有如SEQIDN...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈小芬，
申请(专利权)人：宁波怡和医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33