整合素β4基因DNA甲基化位点在制备哮喘和或COPD早期诊断的生物标志物的应用制造技术

本发明专利技术公开了整合素β4基因DNA甲基化位点在制备哮喘和/或COPD早期诊断的生物标志物的应用。

Application of DNA methylation sites of integrin beta 4 gene in the preparation of biomarkers for early diagnosis of asthma and COPD

The present invention discloses the application of integrin beta 4 gene DNA methylation site in the preparation of biomarkers for early diagnosis of asthma and/or COPD.

【技术实现步骤摘要】
整合素β4基因DNA甲基化位点在制备哮喘和或COPD早期诊断的生物标志物的应用
本专利技术属于生物学
，涉及整合素β4基因DNA甲基化位点在制备哮喘和/或COPD早期诊断的生物标志物的应用，具体涉及一种用于哮喘和/或COPD早期诊断的生物标志物及检测方法。
技术介绍
支气管哮喘(哮喘)和COPD(慢性阻塞性肺疾病)是呼吸系统的常见疾病，但是到目前为止哮喘和COPD临床治疗效果不理想，仍然不能根治，给患者造成了极大的经济负担和心理负担，已经成为全球关注的公众健康问题。有调查发现成人哮喘和COPD在近30年的死亡率和发病率呈递增趋势，占全球疾病总负担1％。据估计，哮喘、COPD相关的肺疾病到2020年将成为人类死亡的第三大原因。目前研究认为哮喘、COPD为多基因遗传与环境因素相互作用导致的复杂疾病。表观遗传学是联系环境因素与遗传易感因素之间的纽带，通过影响基因修饰和调节遗传基因的功能与特性，使机体免疫系统的发育及功能紊乱。DNA甲基化是表观遗传调控中研究得最早，也是最重要的一种修饰方式，它参与了基因－环境间复杂的相互作用，与基因调控、生物发育以及疾病的发生密切相关。DNA甲基化主要表现为DNA序列中的腺嘌呤或胞嘧啶碱基在DNA甲基化转移酶的催化下与甲基发生共价结合，在细胞分裂过程中传递给子细胞的表观遗传现象。DNA的甲基化主要发生于CpG岛，人类基因组中CpG岛大小为100–1000bp，富含CpG二核苷酸，常位于转录调控区附近，与56％的人类基因组编码基因相关，且处于未甲基化状态。基因启动子区DNA高甲基化意味着基因的沉默，而低甲基化意味着基因激活。已有研究证实，DNA甲基化的水平与哮喘、COPD发病密切相关，他们可以作为肿瘤、哮喘、COPD等发病早期风险预测的易感基因。另外，DNA甲基化序列是以一种高度稳定的形式存在于人类血清中，能够抵御RNA酶，蛋白酶的消化作用以及细胞的各种应激状态。综上所述，哮喘、COPD的发病率和病死率近年来呈逐年上升趋势，临床上仍然不能根治，造成了严重的家庭经济负担和社会健康问题。但是，哮喘、COPD作为一类多基因遗传与环境因素相互作用导致的复杂疾病，到目前为止临床上尚无有效的风险预测标志物。由于血清相对比较容易获取，循环血清中的DNA甲基化生物标志物有望作为非侵入式的风险标志物用于哮喘、COPD发病的早期风险预测。
技术实现思路
本专利技术专利技术人前期研究发现：与正常人的气道粘膜上皮相比，哮喘、COPD患者的气道上皮有明显的损伤，脱落，气道及黏膜下组织重构等病理改变。气道上皮细胞的结构功能稳态依赖于上皮细胞粘附分子家族蛋白的表达和结构性粘附。整合素β4是粘附分子家族中的一个非常重要的成员，它组成性的表达在上皮细胞基地膜侧，在气道上皮细胞形成半桥粒结构进而将上皮细胞锚定在基底膜上，整合素β4介导的半桥粒结构是上皮细胞结构粘附的分子基础。哮喘、COPD患者的气道粘膜均存在不同程度的上皮细胞的损伤和脱落，我们思考这种上皮细胞的损伤脱落可能是由于整合素β4基因的DNA甲基化导致的气道上皮整合素β4表达降低所引起的。因此，整合素β4基因DNA甲基化水平及其特异的DNA甲基化位点的突变可能参与并构成哮喘和COPD的发病过程。为了获得一种哮喘、COPD的非侵入式的血清标志物用于哮喘发病风险的早期预测，我们评估了哮喘病人、COPD病人和健康对照人群中整合素β4基因DNA甲基化序列的表达水平及其特异变异的甲基化位点，进一步验证整合素β4基因DNA甲基化序列作为生物标志物区分哮喘人群、COPD人群与健康人群。根据本专利技术的实验数据，表明甲基化的整合素β4基因可用于制备哮喘和/或COPD早期诊断的生物标志物。所述整合素β4基因中覆盖甲基化位点的甲基化区域如SEQIDNO.1—SEQIDNO.3所示。作为哮喘早期诊断生物标志物的所述整合素β4基因的甲基化位点为Chr17：73717793，Chr17：73717747，Chr17：73717737；Chr17：73717722，Chr17：73717720，Chr17：73717703；作为COPD早期诊断生物标志物的所述整合素β4基因的甲基化位点为Chr17：73717808，Chr17：73717793。上述整合素β4基因DNA甲基化位点还可以用于制备哮喘和/或COPD早期诊断试剂盒。所述哮喘和/或COPD早期诊断试剂盒中含有检测整合素β4基因甲基化的引物。所述引物检测整合素β4基因的上述8个甲基化位点。优选地，所述引物如SEQIDNO.4—SEQIDNO.6所示。具体实施方式(1)利用MethylTargetTM甲基化位点评估技术进行评估，明确整合素β4的CpG岛和其它序列信息，为确定候选研究区域提供信息，估算所需片段数和体系数。评估标准A.寻找基因转录起始位点上游2K到第一外显子下游1K区域内CpG岛(包含所有剪切方式)。甲基化CpG岛评估的参数为：Observed/Expectedratio>0.60，PercentC+PercentG>50.00％，Length>200bp。B.片段数评估a)常规(默认评估)：每个CpG岛预计设计一对引物进行检测，对于较长的CpG岛增加(200bp-1K，1对，1K-2K，2对，依此类推)；b)全覆盖：按照每个CpG岛长度进行计算；c)客户指定区间：对指定区间全片段进行引物设计。C.体系数按照每6个片段一个体系估算。评估结果根据<MethylTarget标准评估方法进行操作，对照评估标准，评估结果显示整合素β4基因CpG岛片段总长度为679bp，预计全覆盖有3个片段。(2)收集临床明确诊断为哮喘病人及对照健康对照测试者的外周血收集病例的时间为2016年1月到2016年12月。1、哮喘组选取的对象为中南大学湘雅医院确诊并且符合诊断标准与排除标准的197人，年龄范围为18-60岁，其中男性患者112人，女性患者85人，平均年龄为(35.81±11.37)岁。对照组选择同一时间段在中南大学湘雅医学体检无明显异常人群137人，对照组的年龄范围为18-60岁，其中包括男性87人，女性50人，平均年龄为(37.21±10.62)岁。所有受试者均告知入组的目的，并且全部都签署了知情同意书，并对两组间的性别、年龄、身高进行比较发现无显著性差异，发现哮喘组和对照组具有可比性。为了减少实验误差，故采用统计学方法对哮喘组和对照组的性别和年龄进行匹配。2、COPD选取的对象为中南大学湘雅医院确诊并且符合诊断标准与排除标准的228人，年龄范围为22-65岁，其中男性患者151人，女性患者77人，平均年龄为(42.27±9.47)岁。对照组选择同一时间段在中南大学湘雅医学体检无明显异常人群169人，对照组的年龄范围为27-63岁，其中包括男性98人，女性71人，平均年龄为(41.37±8.57)岁。所有受试者均告知入组的目的，并且全部都签署了知情同意书，并对两组间的性别、年龄、身高进行比较发现无显著性差异，发现哮喘组和对照组具有可比性。为了减少实验误差，故采用统计学方法对哮喘组和对照组的性别和年龄进行匹配。支气管哮喘的诊断标准符合2008年中华医学会呼吸病学分会哮喘学组，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.整合素β4基因DNA甲基化位点在制备哮喘和/或COPD早期诊断生物标志物的应用。

【技术特征摘要】
1.整合素β4基因DNA甲基化位点在制备哮喘和/或COPD早期诊断生物标志物的应用。2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述整合素β4基因中覆盖甲基化位点的甲基化区域如SEQIDNO.1—SEQIDNO.3所示。3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，作为哮喘早期诊断生物标志物的所述整合素β4基因的甲基化位点为Chr17：73717793，Chr17：73717747，Chr17：73717737；Chr17：73717722，Chr17：73717720，Chr17：73717703；作为COPD早期诊断生物标志物的所述整合素β4基因的甲基化位点为Chr17：73717808，Chr17：73717793。4.整合素β4基因DNA甲基化位点在制备哮喘和/或COPD早期诊断试剂盒中的应用。5.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述整合素β4基因...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘持，秦岭，秦晓群，袁琳，唐莎，杜茜子，
申请(专利权)人：中南大学，
类型：发明
国别省市：湖南,43