一种脊髓性肌萎缩症相关基因的检测体系及检测试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及一种脊髓性肌萎缩症相关基因的检测体系及检测试剂盒，属于生物医学领域中的临床分子诊断技术。本发明专利技术的检测体系，能在一个多重复合PCR扩增体系同时扩增检测22个SMN基因致病性突变位点以及3个对照位点。本发明专利技术所提供的检测体系，灵敏度高，分辨率高，在通常利用的100‑500bp检测范围内可清晰、有效地区分1bp差异；检测速度快、需要操作少、可自动化大批量检测，极大降低操作强度和检测成本，4小时内可得到结果。其检测样本可以使用血液、血卡等检材扩增，免除了DNA提取的步骤，操作更加简便，适合于批量操作。该检测对于作为对SMN1第7外显子检测的补充，对SMA研究和携带者筛查具有重要应用价值。

A Detection System and Kit for Genes Related to Spinal Muscular Atrophy

The invention relates to a detection system and a detection kit for genes related to spinal muscular atrophy, belonging to the clinical molecular diagnosis technology in the field of biomedicine. The detection system of the invention can simultaneously amplify and detect 22 pathogenicity mutation sites of SMN gene and 3 control sites in a multiplex PCR amplification system. The detection system provided by the invention has high sensitivity and high resolution, and can distinguish 1 bp difference clearly and effectively within the commonly used detection range of 100 500 bp. The detection speed is fast, needs less operation, and can automate large-scale detection, greatly reducing the operation intensity and detection cost, and the results can be obtained within 4 hours. The detection sample can be amplified by blood, blood card and other samples, which eliminates the steps of DNA extraction and makes the operation more simple and suitable for batch operation. As a supplement to exon 7 detection of SMN1, this detection has important application value for SMA research and carrier screening.

【技术实现步骤摘要】
一种脊髓性肌萎缩症相关基因的检测体系及检测试剂盒
本专利技术涉及一种脊髓性肌萎缩症相关基因的检测体系及检测试剂盒，属于生物医学领域中的临床分子诊断技术。
技术介绍
脊髓性肌萎缩症(spinalmuscularatrophy，SMA)，是一种较常见的遗传性神经肌肉疾病。典型的SMA呈常染色体隐性遗传，患者在婴幼儿阶段发病，特征为脊髓前角运动神经元的变性和缺失，具体临床表现为进行性、对称性肢体躯干及近端肌肉无力和萎缩。SMA按严重度以及发病年龄可分为三个类型：I型(婴儿型)属于最严重的类型，一般于出生后6个月前发病，一生无法独立坐稳、站立，大多数患儿2岁以前会因呼吸衰竭而死亡；II型(中间型)一般于出生后6～18个月发病，能坐，少数可以站或走，但随肌肉持续萎缩会丧失行走能力，大多能活到20-30岁；III型(慢性型)一般于出生18个月之后发病，病程进展较慢，能独立行走，长期存活率较好。SMA相关致病基因携带者频率为1/40～1/60，发病率为1/6000～1/10000，在各人种之间无明显差异。在全世界范围，SMA是携带率和发病率第二高的儿童常染色体致死性遗传病，仅次于囊性纤维病。在我国，SMA是导致婴幼儿死亡的头号常染色体遗传病。脊髓性肌萎缩症的致病基因定位于染色体5q11.2～13.3区域，起关键性作用的基因为运动神经元生存基因1(survivalmotorneuron，SMN1)。SMN1基因全长约20kb，转录产物长约1.7kb，编码294个氨基酸的SMN蛋白，参与构成与RNA加工有关的多蛋白复合体。SMN蛋白在人体组织中普遍表达，脊髓前角运动神经元对其需求较高，若SMN蛋白表达水平过低，会使神经元死亡，导致肌肉的萎缩。SMN基因存在两个高度同源性的拷贝，分别为端粒拷贝(SMN1)和着丝粒拷贝(SMN2)。它们的差别仅有五个碱基，这也造成了对SMN1检测的困难。SMN1可以表达稳定、完整的功能蛋白SMN，而SMN2基因只能表达少量具有活性的SMN蛋白。SMN1是SMA的致病性基因；SMN2本身不会引起SMA，但其拷贝数量会影响SMA的严重程度。典型的SMA呈常染色体隐性遗传。正常人基因组中至少存在一个正常的SMN1拷贝；而典型SMA患者基因组中没有正常的SMN1基因。其中95-98％的SMA患者为SMN1基因缺失(通常称为SMN1第7外显子纯合缺失)，其余2-5％SMA患者仅有一个包含致病性突变的SMN1基因；如一条染色体上携带正常SMN1，另一条染色体无正常SMN1，此种情况称为SMA携带者。携带者个体不会表现SMA症状，但如果男女双方都是携带者，有25％的风险生育SMA患儿。针对SMN1基因检测不仅是SMA诊断的重要依据，也可为携带者筛查和生育指导提供指导。目前针对SMN1第7外显子缺失检测的研究和应用相对较多，通常使用多重连接依赖探针扩增(MLPA)、荧光定量PCR(qPCR)等方法定量检测SMN1第7外显子拷贝数。而对于SMN1基因的致病性突变，目前研究相对较少，也没有适于应用的检测方法。对于患者确诊或者先证者亲属诊断，SMN1基因的致病性突变的检测可以通过测序等方法进行。但是对于携带者筛查，测序等方法从成本和工作量上不具备可行性。如果只进行SMN1第7外显子检测，则会有相当比例的致病性突变携带者漏检。因此，急需开发一种适于批量检测的SMN1基因的致病性突变检测方法。这对于SMA研究和携带者筛查具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种同时检测22种常见SMN基因致病性突变的检测体系及试剂盒。检索孟德尔遗传数据分析库(On-lineMendelianInheritanceinMan，OMIN)数据及相关研究文献，选择确定明确致病且相对高发的SMN基因致病性突变位点共22个。其中7个位点为文献报道的中国人群中的高发突变位点。本专利技术所提供的检测体系，能同时扩增检测上述22个SMN基因致病性突变位点以及3个对照位点。该体系所包含的22个位点信息见表1：表1检测位点列表所述第一组荧光标记为FAM，第二组荧光标记为HEX，其中所述两组位点从上往下的顺序均为实际检测结果图中从小到大的片段排列顺序。本专利技术还提供根据该检测体系设计的试剂盒。本专利技术所述检测体系，采用的是等位基因特性PCR(allele-specificPCR，ASPCR)结合定量荧光PCR(QuantitiveFluorescentPCR，QF-PCR)的方法对目的位点进行扩增，通过毛细管电泳进行扩增产物的检测，完成对目的位点分型的检测。对于每个检测位点设置三条引物，对两种分型分别设置一条不同长度的特异引物，以及一条荧光标记的上游或下游引物。每条特异引物只能与对应基因型的DNA模板结合并进行扩增。完成PCR扩增和毛细管电泳检测后，通过特定荧光标记、特定长度的扩增产物的有无即可判定样本特定位点是否存在特定基因型。本专利技术方法的特点：1)使用遗传分析仪通过毛细管电泳检测扩增产物：遗传分析仪检测平台是广泛使用的主流检测平台之一。通过毛细管电泳对荧光标记的扩增产物进行检测，检测的主要技术优势在于：①，检测灵敏度高。毛细管电泳结合使用荧光染料大幅提高了检测灵敏度，比琼脂糖电泳检测灵敏度高100倍以上。能更灵敏地检测到扩增产物，并且明确区分扩增野生型和突变型。另一方面，由于检测灵敏度高，为复合PCR扩增反应提供了更大调整空间。更重要的是，由于检测灵敏度高，降低了对PCR扩增产物量的要求，可以可以降低PCR扩增循环数、降低样本量需求。②，检测分辨率高。在通常利用的100-500bp检测范围内可清晰、有效地区分1bp差异。如此高的分辨率使得不会由于产物大小接近而产生误判，也避免了非特异扩增引起的结果误判。另一方面，高分辨率还使得同时检测更多位点成为可能。③，可以同时对多种荧光信号检测。更进一步拓展了检测范围，使得同时检测更多位点成为可能。④，检测速度快(40分钟)、需要操作少、可自动化大批量检测。⑤，检测结果可利用软件自动分析判型。2)通过一个多重复合PCR扩增体系同时扩增多个位点：本专利利用一个多重复合PCR扩增体系，实现了对22个SMN基因致病性突变位点的检测。其优势在于：①，极大降低操作强度和检测成本。只一个PCR扩增和一个遗传分析仪检测反应即可完成全部检测。②，单管扩增检测，最大程度上避免了污染和样品混淆等错误。③，可以直接使用血液、血卡等检材扩增，免除了DNA提取的步骤，操作更加简便，适合于批量操作。3)位点全面：本体系涵盖了所有已报道的高频SMN基因致病性突变位点，以及中国人群中高发SMN基因致病性突变位点，共22个。该检测对于作为对SMN1第7外显子检测的补充，对SMA研究和携带者筛查具有重要应用价值。综上，本专利提供一个同时检测22个SMN基因致病性突变位点的检测体系。其主要优点包括：每个样品只需一个扩增检测反应，一管反应可以得到22个位点的检测结果，极大降低操作强度；4小时内可得到结果。附图说明图1，样本A的扩增检测结果图，图2，样本B的扩增检测结果图，图3，样本C的扩增检测结果图。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术做进一步的详细说明。实施例一、检测体系PCR扩增体系主要组分包含热启动DNA聚合酶、UDG酶、dNTP、扩增本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种脊髓性肌萎缩症相关基因的PCR检测体系，其特征在于同时对以下22个位点进行检测：Exon3 283G/C位点、Exon7 863G/T位点、Exon3 305G/A位点、Intron6 835‑1G/A位点、Exon3 346A/T位点、Exon5 683T/A位点、Exon3 389A/G位点、Exon3 400G/A位点、Exon3 406C/G位点、Exon1 22insA位点、Exon1 5C/G位点、Exon2 88G/A位点、Exon5 689C/T位点、Exon2 131A/T位点、Exon3 332C/G位点、Exon6 785G/T位点、Exon3 388T/C位点、Exon6 821C/T位点、Exon6 830A/G位点、Exon6 815A/G位点、Exon6 784A/G位点、Exon7 836G/T位点。

【技术特征摘要】
1.一种脊髓性肌萎缩症相关基因的PCR检测体系，其特征在于同时对以下22个位点进行检测：Exon3283G/C位点、Exon7863G/T位点、Exon3305G/A位点、Intron6835-1G/A位点、Exon3346A/T位点、Exon5683T/A位点、Exon3389A/G位点、Exon3400G/A位点、Exon3406C/G位点、Exon122insA位点、Exon15C/G位点、Exon288G/A位点、Exon5689C/T位点、Exon2131A/T位点、Exon3332C/G位点、Exon6785G/T位点、Exon3388T/C位点、Exon6821C/T位点、Exon6830A/G位点、Exon6815A/G位点、Exon6784A/G位点、Exon7836G/T位点。2.根据权利要求1中所述的检测体系，其特征在于，采用多重等位基因特异性PCR扩增和毛细管电泳检测。3.根据权利要求1或2中所述的检测体系，所述体系中还能检测对照位点。4.根据权利要求3中所述的检测体系，所述对照位点为性别Amel基因、人类身份识别位点PentaD和PentaE中的一种或多种。5.根据权利要求4中所述的检测体系，所述检测体系加入有检测位点的引物：Exon3283G/C位点：正向共用引物：5’-ACCTCCCCACTGATCAAAACG-3’，反向野生型引物：5’-ATGGCAGAACATTTGTACAC-3’，反向突变型引物：5’-ATTAATGGCAGAACATTTGTACAG-3’；Exon3305G/A位点：正向共用引物：5’-ACCTCCCCACTGATCAAAACG-3’反向野生型引物：5’-GTAAATGCAACCGTCTTCTGACC-3’反向突变型引物：5’-ATTAGTAAATGCAACCGTCTTCTGACT-3’Exon3346A/T位点：正向共用引物：5’-ACCTCCCCACTGATCAAAACG-3’，反向野生型引物：5’-AACACAGGTTTCTCTCTTAAAATCAAT-3’，反向突变型引物：5’-ATTAAACACAGGTTTCTCTCTTAAAATCAAA-3’；Exon3389A/G位点：正向共用引物：5’-ACCTCCCCACTGATCAAAACG-3’，反向野生型引物：5’-AGATTTTGCTCCTCTCTATTTACAT-3’，反向突变型引物：5’-ATTAAGATTTTGCTCCTCTCTATTTACAC-3’；Exon3400G/A位点：正向共用引物：5’-ACCTCCCCACTGATCAAAACG-3’，反向野生型引物：5’-AAAGTAGATCGGACAGATTTTGCTACAC-3’，反向突变型引物：5’-ATTAAAAGTAGATCGGACAGATTTTGCTACAT-3’；Exon3406C/G位点：正向共用引物：5’-ACCTCCCCACTGATCAAAACG-3’，反向野生型引物：5’-AACACAGATTGGGGAAAGTAGATCGGACAGATATGG-3’，反向突变型引物：5’-ATTAAACACAGATTGGGGAAAGTAGATCGGACAGATATGC-3’；Exon3332C/G位点：正向野生型引物：5’-GACGGTTGCATTTACCCAGC-3’，正向突变型引物：5’-ATTAGACGGTTGCATTTACCCAGG-3’，反向共用引物：5’-CTCATCTAGTCTCTGCTTCCAGAAA-3’；Exon3388T/C位点：正向野生型引物：5’-CCTGTGTTGTGGTTTACACTGGAT-3’，正向突变型引物：5’-ATTACCTGTGTTGTGGTTTACACTGGAC-3’，反向共用引物：5’-CTCATCTAGTCTCTGCTTCCAGAAA-3’；Exon6815A/G位点：向野生型引物：5’-ATGTTAATTTCATGGTACATGAGTGGCTA-3’，正向突变型引物：5’-ATTAATGTTAATTTCATGGTACATGAGTGGCTG-3’，反向共用引物：5’-CTCATCTAGTCTCTGCTTCCAGAAA-3’；Exon6784A/G位点：正向野生型引物：5’-GGGCTTCCTCTTGAACACG-3’，正向突变型引物：5’-GGCTGGGCTTCCTCTTGAACACA-3’，反向共用引物：5’-GGGAGGATGGAAAACAGAGACTTAC-3’；Exon6785G/T位点：正向共用引物：5’-AATCTCCAGACTTTACTTTTTTGTTTACT-3’，正向野生型引物：5’-CCACTCATGTACCATGAAATTAACATAC-3’，反向突变型引物：5’-ATTACCACTCATGTACCATGAAATTAACATAA-3’；Exon6830A/G位点：正向共用引物：5’-AATCTCCAGACTTTACTTTTTTGTTTACT-3’，正向野生型引物：5’-GTCAGGAAAAGATGCTGAGTGATTACTTACCATAT-3’，反向突变型引物：5’-ATTAGTCAGGAAAAGATGCTGAGTGATTACTTACCATAC-3’；Exon...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱海燕，
申请(专利权)人：中国人民解放军海军总医院，
类型：发明
国别省市：北京,11