人-人细胞融合母胎血型不合治疗杂交株的制备制造技术

一种用于医学领域的人‑人细胞融合母胎血型不合治疗杂交株的制备，其特征在于，以促红细胞生成素为诱导剂，培养Rh阳性“O”型人骨髓细胞，以增加定向发育的红系细胞，继之将培养后的人骨髓细胞与人骨髓瘤细胞融合为杂交细胞，再以促红细胞生成素诱导杂交细胞定向分化，以HAT筛选杂交细胞克隆，以Rh抗体筛选能在体外无限扩增的Rh阳性细胞杂交株，经产业化扩增后作为吸附剂，制成吸附器，然后与血液分离器共同构成体外吸附装置，通过吸附母胎血型不合孕妇外周血浆中的致病性Rh抗体，创建不清除血浆及其有益成份的无需血浆置换液的廉价安全的母胎血型不合溶血病的治疗新方法。

Preparation of Human-Human Cell Fusion Maternal-Fetal Blood Group Incompatibility Therapeutic Hybrid Strain

The preparation of a hybrid strain for the treatment of maternal-fetal blood group incompatibility of human-human cell fusion in medical field is characterized in that Rh-positive \O\ human bone marrow cells are cultured with erythropoietin as an inducer to increase the directional development of erythrocyte, and then the cultured human bone marrow cells and human myeloma cells are fused into hybrids, and the hybrids are induced with erythropoietin. Cross-cell directional differentiation, HAT screening of hybridized cell clones, Rh antibody screening of Rh-positive cell hybrids that can infinitely expand in vitro, after industrial expansion as adsorbent, made an adsorber, and then with the blood separator together constitute an in vitro adsorption device, by adsorbing pathogenic Rh antibodies in maternal and fetal blood group incompatible pregnant women's peripheral plasma, to create unclear plasma and its benefits. An inexpensive and safe method for the treatment of maternal-fetal blood group incompatible hemolytic disease without plasma exchange solution.

【技术实现步骤摘要】
人-人细胞融合母胎血型不合治疗杂交株的制备
本专利技术涉及医学领域母胎血型不合治疗杂交株的制备，主要用于母胎Rh血型不合孕妇血浆中抗胎儿红细胞抗体的吸附清除。
技术介绍
人类有ABO、Rh、MN、Lew和Kell等26种血型，其中最重要的是ABO血型和Rh血型，ABO血型根据红细胞携带的A抗原、B抗原、AB抗原或无A和B抗原分为A型、B型、AB型和O型；Rh血型根据红细胞是否携带D抗原分为Rh阳性和Rh阴性，Rh阳性的红细胞上含有D抗原，能与抗-D血清发生免疫凝集。在我国汉族人群中Rh阴性的频率约为0.4％，而西北地区少数民族以及某些国家Rh阴性的频率高达10％以上，所以这些地区和国家Rh血型不合溶血病的发生率较我国汉族人群高。血型抗原遗传自父母双亲，胎儿红细胞可以携带来自于父亲的血型抗原，表现为不同于母体的血型，此时当胎儿的红细胞进入母体的血液循环时，可诱发母体产生抗体，进而通过胎盘进入胎儿体内，结合并破坏胎儿红细胞，导致胎儿和/或新生儿的溶血病。其中母胎ABO血型不合的发生率较高，但胎儿溶血病的发生率较低，即使发生亦较轻，极少引起核黄疸和水肿，妊娠期无需特殊处理。而Rh血型不合由于Rh阴性母体产生大量的抗Rh阳性胎儿红细胞的Rh抗体(IgG抗-D)，进入胎儿血液循环后，IgG抗-D与Rh阳性胎儿红细胞表面的D抗原发生免疫结合，致使大量的胎儿红细胞被破坏，使胎儿严重贫血、缺氧、心衰、肝脏损伤、低蛋白血症、全身水肿、胸水、腹水甚至胎死宫内。在新生儿时期，Rh血型不合溶血出现黄疸的时间较ABO血型不合溶血者早，最早可在出生后12小时内出现，多数在24小时内出现。由于溶血产生的大量胆红素不能及时排除，使新生儿黄疸加重，大量的胆红素渗入脑细胞而引起核黄疸，常死于严重贫血、心力衰竭、核黄疸，死亡率很高。虽然某些孕妇可通过预先注射Rh抗体来预防母胎Rh血型不合溶血病的发生，但目前大多数国家已禁止使用D抗原免疫志愿者，因此多克隆Rh抗体的来源已十分有限，而将EB病毒转化淋巴细胞或先转化后杂交制备的Rh抗体用于体内，仍存在EB病毒、HIV和肝炎病毒等病原体的潜在致病性问题，以及用杂交瘤技术制备的Rh抗体因带有鼠癌基因或含有鼠源蛋白而易引起过敏反应等，从而使通过体内注射Rh抗体预防Rh溶血病的方法受到了限制。目前临床上对母胎Rh血型不合溶血病的治疗主要有孕期血浆置换、胎儿输血、终止妊娠和新生儿换血治疗。如对高胆红素血症的新生儿主要采用换血治疗或蓝光照射、注射免疫球蛋白；妊娠期抗-D效价在1∶32以上时需考虑宫内输血，包括胎儿腹腔内输血或血管内输血，这两者均有一定风险且无一被证实有效；妊娠期抗-D效价在1∶64以上时，需考虑血浆置换治疗，即在体外循环通路中以滤过法分离孕妇的血细胞和血浆，去除血浆并以等量的新鲜冰冻血浆或5％白蛋白作为置换液补充回输(每次置换量为2000～3000ml、速度为20～30ml/min、治疗时间为2～4h、每1～3d治疗1次)。或每次取孕妇全血约400ml，低温离心后去其血浆约300ml，补充等量同型新鲜血浆，还输自身红细胞。血浆置换能与被去除的血浆量成比例地降低致病抗体的滴度(效价)，从而能延长胎儿在母体内的存活和发育时间，是母胎ABO、Rh或其它血型不合孕妇临床早期保胎治疗的良好选择，无明显的不良反应，具有较好的疗效。但血浆置换只能去除血液中的部分抗体，不能终止抗体的继续产生，也不能逆转已发生的母胎血型不合溶血病，需要进行不间断的血浆置换才有效，仅适用于曾在妊娠20～22周前发生过胎儿水肿或配偶为纯合子致病抗原的孕妇，特别是在去除部分致病抗体的同时，也去除了含多种有益成份的大量血浆，虽然以置换液作了补充，但无法完全补足被去除的血浆及其有益成份，而且替补的置换液用量大，费用昂贵，异体血浆易致传染病和输液反应等，这也限制了血浆置换的普遍开展。有文献报道，可以采用Rh阳性“O”型人红细胞或恒河猴红细胞，经特殊处理后，制成Rh阳性红细胞吸附器(柱)，进而与血液分离器组装成体外循环装置，用于清除孕妇体内的Rh抗体，即将孕妇的外周血引出体外循环装置，以血液分离器分离出血浆和血细胞，血浆中的Rh抗体经过Rh阳性红细胞吸附器(柱)时，其中的Rh抗体被Rh阳性红细胞吸附，吸附Rh抗体后的血浆流出吸附器(柱)后，与之前分离的血细胞汇合，然后回输体内，达到治疗目的。从理论上看这种治疗方法明显优于现有的治疗方法，但存在的问题是，这些文献还没有提出Rh阳性“O”型红细胞的体外扩增方法，所用的Rh阳性“O”型人红细胞或恒河猴红细胞只能直接取自Rh阳性的人体或恒河猴。因没有建立在体外无限扩增Rh阳性“O”型人红细胞或恒河猴红细胞的方法，所以这些文献报道的治疗方法对Rh阳性“O”型人或恒河猴具有依赖性，难以达到脱离生物体的产业化应用，并具有异体血源输入的风险。另有文献报道，克勒(Kohler)和米尔斯坦(Milstein)于1975证明，骨髓瘤细胞与免疫的动物脾细胞杂交，形成能分泌针对相应抗原的高特异性抗体--单克隆抗体，这种技术通称为杂交瘤技术。骨髓瘤细胞可以在体外连续传代，而脾细胞不能在体外繁殖。如果将小鼠的骨髓瘤细胞与能分泌某种抗体或因子的淋巴细胞杂交，则杂交细胞既具有肿瘤细胞无限繁殖的特性，又具有淋巴细胞分泌特异性抗体或因子的能力，同时也克服了免疫淋巴细胞不能在体外无限繁殖的缺点，这种杂交的细胞称为淋巴细胞杂交瘤。根据以上文献报道，申请人以Rh阳性“O”型人红细胞与能无限生长的鼠骨髓瘤细胞进行融合，试图制备既具有Rh阳性“O”型人红细胞的抗原性又具有骨髓瘤细胞无限生长特性的融合细胞，以通过融合细胞的无限扩增而扩增Rh阳性“O”型人红细胞(成份)，以建立人-鼠细胞融合母胎血型不合治疗杂交株的制备方法，但始终未获得成功。继之又试图分别以EB病毒、SV40LT(猴肾病毒SV40大T抗原)、hTERT(端粒酶逆转录酶)转染的方法制备永生化骨髓细胞株，并试图培养、筛选出Rh阳性“O”型人红细胞系，用以建立Rh阳性“O”型人红细胞的体外扩增方法，也始终未能获得成功。申请人还试图找到或试制出能吸附Rh抗体的非红细胞类材料，也至今未果。为了实现只去除致病抗体而不会去除血浆及其多种有益成份的廉价、安全和无副作用的母胎血型不合溶血病的治疗，以及为了节省血源，必须创建一种Rh阳性“O”型红细胞(成份)的无限扩增方法，以产业化制备Rh阳性“O”型红细胞(成份)，进而作为吸附剂用于Rh抗体吸附器(柱)的产业化制备。
技术实现思路
为了解决长期困绕的母胎血型不合溶血病的治疗问题，本专利技术人提出了本专利技术。本专利技术的目的是要提供母胎血型不合治疗杂交株的制备方法，另一目的是要提供所制杂交株在治疗母胎血型不合溶血病中的应用。本专利技术的目的是这样实现的：以促红细胞生成素为诱导剂，培养Rh阳性“O”型人骨髓细胞，以增加定向发育的红系细胞，继之将人骨髓细胞与人骨髓瘤细胞配制成混合细胞，经聚乙二醇的作用融合为杂交细胞，再以促红细胞生成素诱导杂交细胞定向分化，以HAT筛选杂交细胞克隆，以Rh抗体试剂筛选能在体外无限扩增的Rh阳性红细胞杂交株，经进一步扩增后作为吸附剂，制成吸附器，用于吸附母胎血型不合溶血病的致病抗体。较具体的说，以含1.5～2.5IU/ml促本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种人‑人细胞融合母胎血型不合治疗杂交株的制备，其特征在于，在人骨髓细胞融合前的细胞增量培养及在增量培养后的人骨髓细胞与人骨髓瘤细胞的融合、杂交细胞筛选、克隆化培养和传代扩增中，以促红细胞生成素刺激红系的定向分裂、Rh抗原的分化成熟，制成能在体外无限扩增的Rh阳性“O”型人红系杂交株，用于制备吸附器，进而与血浆分离器构成母胎血型不合致病抗体吸附治疗装置。

【技术特征摘要】
1.一种人-人细胞融合母胎血型不合治疗杂交株的制备，其特征在于，在人骨髓细胞融合前的细胞增量培养及在增量培养后的人骨髓细胞与人骨髓瘤细胞的融合、杂交细胞筛选、克隆化培养和传代扩增中，以促红细胞生成素刺激红系的定向分裂、Rh抗原的分化成熟，制成能在体外无限扩增的Rh阳性“O”型人红系杂交株，用于制备吸附器，进而与血浆分离器构成母胎血型不合致病抗体吸附治疗装置。2.根据权利要求1所述的人-人细胞融合母胎血型不合治疗杂交株的制备，其特征在于，在骨髓细胞融合前的细胞增量培养中，将促红细胞生成素按1.5～2.5IU/mL的用量配入常规骨髓细胞培养基。3.根据权利要求1所述的人-人细胞融合母胎血型不合治疗杂交株的制备，其特征在于，在细胞融合、杂交细胞筛选、克隆化培养和传代扩增中，将促红细胞生成素按0.5～0.9IU/mL的用量配入15％胎牛血清的DMEM培养基。4.根据权利要求1所述的人-人细胞融合母胎血型不合治疗杂交株的制备，其特征在于，所述Rh阳性“O”型人红系杂交株以0.04mol/LNa2HPO4和0.04mol/LNaH2PO4配制的渗透浓度分别为25mmol/L和35mmol/L的PB裂解液交替洗涤其含有的血红蛋白。5.根据权利要求1所述的人-人细胞融合母胎血型不合治疗杂交株的制备，其特征在于，所述吸附器内部灌注以含3.5％甘露醇的细胞保存液配成的80％Rh阳性“O”型人红系杂交株浓度的细胞悬...

【专利技术属性】
技术研发人员：翁炳焕，李兰娟，苏岚，叶光勇，应俊，
申请(专利权)人：翁炳焕，
类型：发明
国别省市：浙江,33