一种弧菌DNA电化学传感器及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种弧菌DNA电化学传感器及其制备方法和应用。先将氧化石墨烯在含有氨基离子液体的N,N‑二甲基甲酰胺溶液中进行剥离，制备离子液体功能化石墨烯；然后在上述分散液中制备类水滑石纳米片，制得离子液体功能化石墨烯‑类水滑石纳米片复合物，采用滴涂法制备该复合物修饰的玻碳电极，再将弧菌探针ssDNA通过生物连接剂固定在修饰电极表面，制备所述的弧菌DNA传感器。该DNA传感器具有良好的灵敏性和选择性、较低的检测限和较宽的线性范围。该制备方法包括：修饰电极材料的制备；电化学副溶血性弧菌DNA传感器的制备；电化学副溶血性弧菌DNA传感器与目标DNA的杂交；传感器电化学信号检测。

【技术实现步骤摘要】
一种弧菌DNA电化学传感器及其制备方法和应用
：本专利技术属于生物电化学传感器
，具体涉及一种弧菌DNA电化学传感器及其制备方法，以及用于高灵敏检测致病性副溶血性弧菌的特异性DNA。
技术介绍
：海洋弧菌是一类活动力极强的棒状或弧状革兰氏阴性菌，广泛分布于半咸水、沿岸、河口、海洋水体、沉积物和海洋生物体内，分布在全球河口环境中的一种革兰氏阴性菌，当食用生的、未煮熟的或处理不当的海鲜时，会引起人类急性胃肠炎。其中以副溶血性弧菌的危害最大，研究发现副溶血性弧菌株中都发现了tlh基因，因此它被认为是检测总副溶血性弧菌的一个有用的指标。近年来，DNA电化学生物传感器以其成本低、灵敏度高、响应速度快、选择性好以及仪器小型化等优点引起了人们的广泛关注。迄今为止，各种类型的DNA电化学生物传感器以其广泛的纳米材料如类水滑石(LDH)、碳纳米管(CNTs)和石墨烯(GR)等，被用于提高DNA生物传感器的灵敏度和稳定性，但用于检测弧菌的DNA传感器在灵敏度和检测限方面仍然有很大提升空间。石墨烯(GR)是一种sp2杂化碳原子组成的具有一个碳原子厚度的二维材料，于2004年由Geim首次成功制备，因其具备优良的机械性能和电性能，近年来引起了各个领域研究的广泛关注。化学还原是一种低成本的方法，因此被广泛应用于GR的大规模工业生产。然而在生产过程中，GR片层间会因强的π-π相互作用而发生不可逆的堆叠，这不仅损害了GR的分散性能，同时也增大了片层间的接触电阻，从而严重限制了GR的电化学性能以及其在各个领域内的应用。类水滑(简写为LDH)是一类二维纳米阴离子粘土，组成通式可表示为[M1-x2+Mx3+(OH)2]x+(An-)x/n·mH2O，具有水滑石层状结构且片层携带正电荷，层间存在可交换的阴离子。类水滑石纳米片(LDHNS)是指其以单层或几层类水滑石纳米片形式存在，不仅具有原始LDH的各种性能，同时还呈现出开放的内表面、分子厚度的正电层、大的比表面积和丰富的活性位点等特点，因此极大扩展了LDH的应用领域。因此研究者将带正电荷的LDHNS与GR进行复合来阻止两种组分的聚集，提高复合物的导电性能。虽然复合的方案可以解决GR片堆叠和LDHNS聚集的问题，但复合后的杂化物容易沉降，整体分散性较差，而且作为电极修饰材料其导电性也需进一步提高。氨基功能化离子液体不仅是一种高导电性、具有特殊溶解性能的绿色溶剂，而且具有功能性的氨基，因此可能通过与GO表面大量的环氧环发生开环反应，修饰到基于GO/GR复合材料表面。由于特殊的溶解性、大量的电荷以及高的导电性，离子液体的引入可以大大提高GO/GR基材料的分散性、稳定性和导电性。本专利技术先使用氨基功能化离子液体对GO进行剥离，再在甲酰胺介质中合成LDHNS，从而制备离子液体功能化石墨烯-类水滑石纳米片(IL-GR-LDHNS)复合物，以此IL-GR-LDHNS复合膜修饰的玻碳电极为基础，建立了一种高灵敏的弧菌DNA杂交检测方法。IL-GR-LDHNS复合膜不仅能够有效地固定DNA，而且具有大的比表面积，丰富的活性位点，良好的生物相容性、导电性和分散性，有效地促进了电子转移。与其它报道的方法相比，该方法对目标DNA的检出限较低，线性范围宽，选择性好，可实现对弧菌特征DNA的高灵敏无标记检测。
技术实现思路
：针对现有DNA传感检测技术的不足以及本领域研究和应用的需求，本专利技术的目的之一是提供一种弧菌DNA电化学传感器，所述DNA传感器以玻碳电极为基底电极，离子液体功能化石墨烯-类水滑石纳米片复合膜作为电极修饰材料，探针ssDNA通过生物连接剂1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺共价键合的方式固定在修饰电极表面；所述离子液体功能化石墨烯-类水滑石纳米片复合膜是先将氧化石墨烯在含有氨基离子液体的N,N-二甲基甲酰胺溶液中进行剥离，制备离子液体功能化石墨烯；然后在上述分散液中制备类水滑石纳米片，制得离子液体功能化石墨烯-类水滑石纳米片复合物；所述玻碳电极记为GCE；所述N,N-二甲基甲酰胺记为DMF；所述氧化石墨烯记为GO，石墨烯记为GR；所述类水滑石纳米片记为LDHNS；所述离子液体为1-甲基-3-氨丁基咪唑四氟硼酸盐，记为IL，其结构式如下：本专利技术的目的之二是提供一种弧菌DNA电化学传感器的制备方法，其特征在于包括以下具体步骤：(1)IL-GR-LDHNS复合物的制备将一定量的GO加入到100mL含有200mgIL的甲酰胺中，超声分散2h，得到GO浓度为0.5～1.5mg/mL的IL-GO分散液；按一定摩尔比向其中加入MgCl2·6H2O和AlCl3·9H2O，使总金属离子浓度为0.03mol/L，搅拌1h使金属盐完全溶解，在搅拌条件下，用浓度为0.5mol/L的氢氧化钠的甲酰胺溶液缓慢滴定至反应液的pH约为9.0～10.0，室温搅拌反应12h，之后在30～70℃条件下老化12h，反应液在8000rpm转速下离心10min，分别用乙醇和去离子水洗涤3次，室温自然干燥后即得离子液体功能化石墨烯-类水滑石纳米片复合物，记为IL-GR-LDHNS；(2)IL-GR-LDHNS修饰玻碳电极的制备将玻碳电极用0.05μm的A12O3抛光粉抛光后，用双蒸水冲洗干净，并在超声水浴中超声5min，用高纯氮气吹干；将步骤(1)中得到的IL-GR-LDHNS复合物超声分散于去离子水中，配制成浓度为3mg/mL的分散液，取0.5～50μL该分散液滴涂在处理好的玻碳电极表面，自然晾干后得到IL-GR-LDHNS修饰的玻碳电极，记为IL-GR-LDHNS/GCE；(3)DNA传感器的制备将IL-GR-LDHNS/GCE浸入0.4mol/L1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺和0.1mol/LN-羟基琥珀酰亚胺的混合溶液中30min，使修饰电极表面羧基化；取1～100μL浓度为1×10-6mol/L的探针ssDNA溶液滴涂于修饰电极表面，在25～70℃下孵育2h，依次用pH为7.4的PBS和双蒸水对电极进行冲洗，除去未固定的探针ssDNA，室温自然干燥后得DNA传感器。其中步骤(1)中MgCl2·6H2O和AlCl3·9H2O的摩尔比为2：1；老化过程中IL在碱性介质中与GO分子上的环氧环发生开环反应，实现了IL对GO的共价修饰和部分还原；在甲酰胺介质中制备的LDHNS具有超薄特性，厚度约为0.7～2nm；步骤(2)中所述抛光后的玻碳电极，采用三电极系统检测，在[Fe(CN)6]3-/4-溶液中，设置电压为-0.4～0.8V，对玻碳电极进行循环伏安扫描，若氧化还原峰电位差在0～100mV内，则说明电极表面已处理好，否则重新处理，直至符合要求为止。本专利技术目的之三是提供一种弧菌DNA电化学传感器用于弧菌的检测应用。具体包括以下具体步骤：(1)DNA传感器与目标ssDNA的杂交将不同浓度互补DNA滴入固定有探针的电极表面，在35℃下孵育50min进行杂交，杂交后依次用PBS(pH为7.4)和双蒸水对电极进行冲洗，去除未杂交的目标DNA，即完成DNA分子在电极表面的杂交。(2)传感器的电化学信号检测采用循环伏安(CV)和差分脉冲伏安法(DPV)进行检测，以不同的修饰玻碳电极作为工作电极，铂丝电极本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种弧菌DNA电化学传感器，其特征在于所述弧菌DNA电化学传感器以玻碳电极为基底电极，离子液体功能化石墨烯‑类水滑石纳米片复合膜作为电极修饰材料，探针ssDNA通过生物连接剂1‑乙基‑3‑(3‑二甲基氨丙基)碳二亚胺和N‑羟基琥珀酰亚胺共价键合的方式固定在修饰电极表面；所述离子液体功能化石墨烯‑类水滑石纳米片复合膜是先将氧化石墨烯在含有氨基离子液体的N,N‑二甲基甲酰胺溶液中进行剥离，制备离子液体功能化石墨烯，然后在上述分散液中制备类水滑石纳米片，制得离子液体功能化石墨烯‑类水滑石纳米片复合物；所述玻碳电极记为GCE；所述N,N‑二甲基甲酰胺记为DMF；所述氧化石墨烯记为GO，石墨烯记为GR；所述类水滑石纳米片记为LDHNS；所述离子液体为1‑甲基‑3‑氨丁基咪唑四氟硼酸盐，记为IL，其结构式如下：

【技术特征摘要】
1.一种弧菌DNA电化学传感器，其特征在于所述弧菌DNA电化学传感器以玻碳电极为基底电极，离子液体功能化石墨烯-类水滑石纳米片复合膜作为电极修饰材料，探针ssDNA通过生物连接剂1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺共价键合的方式固定在修饰电极表面；所述离子液体功能化石墨烯-类水滑石纳米片复合膜是先将氧化石墨烯在含有氨基离子液体的N,N-二甲基甲酰胺溶液中进行剥离，制备离子液体功能化石墨烯，然后在上述分散液中制备类水滑石纳米片，制得离子液体功能化石墨烯-类水滑石纳米片复合物；所述玻碳电极记为GCE；所述N,N-二甲基甲酰胺记为DMF；所述氧化石墨烯记为GO，石墨烯记为GR；所述类水滑石纳米片记为LDHNS；所述离子液体为1-甲基-3-氨丁基咪唑四氟硼酸盐，记为IL，其结构式如下：所述弧菌DNA电化学传感器的制备方法，其特征在于包括以下具体步骤：(1)IL-GR-LDHNS复合物的制备将一定量的GO加入到100mL含有200mgIL的甲酰胺中，超声分散2h，得到GO浓度为0.5～1.5mg/mL的IL-GO分散液；按一定摩尔比向其中加入MgCl2·6H2O和AlCl3·9H2O，使总金属离子浓度为0.03mol/L，搅拌1h使金属盐完全溶解，在搅拌条件下，用浓度为0.5mol/L的氢氧化钠的甲酰胺溶液缓慢滴定至反应液的pH约为9.0～10.0，室温搅拌反应12h，之后在30～70℃条件下老化12h，反应液在8000rpm转速下离心10min，分别用乙醇和去离子水洗涤3次，室温自然干燥后即得离子液体功能化石墨烯-类水滑石纳米片复合物，记为IL-GR-LDHNS；(2)IL-GR-LDHNS修饰玻碳电极的制备将玻碳...

【专利技术属性】
技术研发人员：詹天荣，李凯利，田夏，
申请(专利权)人：青岛科技大学，
类型：发明
国别省市：山东,37