一种可产新霉素的弗氏链霉菌株的高通量筛选方法技术

本发明专利技术提供一种可产新霉素的弗氏链霉菌株的高通量筛选方法，步骤如下：（1）将弗氏链霉菌单菌落孢子接种于斜面培养基和发酵培养基的多孔板中，发酵培养结束经硫酸酸化，离心取上清液用水稀释；（2）发酵稀释液与0.25%磷钨酸反应生成沉淀物；（3）用酶标仪测定OD值进行复筛；（4）将待复筛菌株的孢子分别接种于大试管斜面或茄子瓶斜面和摇瓶发酵培养，用硫酸酸化；（5）酸化液经过滤稀释与0.25%磷钨酸在酶标板中反应测定OD值；（6）选出的菌株摇瓶发酵后进行精筛，测定生物效价，得高产菌株。本发明专利技术操作便捷、快速准确，很大程度上提高了新霉素诱变育种的筛选效率，使获得新霉素高产菌株的几率大大提高。

A High Throughput Screening Method for Streptomyces freundii Strains Producing Neomycin

The present invention provides a high-throughput screening method for strains of Streptomyces freundii capable of producing neomycin. The steps are as follows: (1) inoculating single colony spores of Streptomyces freundii into porous plates of inclined medium and fermentation medium, acidifying after fermentation, diluting supernatant by centrifugation; (2) reacting fermentation diluent with 0.25% phosphotungstic acid to form precipitate; (3) using enzyme standard. The OD value was determined by the instrument for re-screening; (4) The spores of the strains to be re-screened were inoculated on the inclined plane of the large test tube or the inclined plane of the eggplant bottle and fermented in shaking flask, and then acidified with sulfuric acid; (5) the acidified liquid was filtered and diluted and reacted with 0.25% phosphotungstic acid in the enzyme plate to determine the OD value; (6) the selected strains were screened after shaking flask fermentation, and the biological titer was determined to obtain high- The method has the advantages of convenient operation, fast and accurate operation, greatly improving the screening efficiency of mutation breeding of neomycin, and greatly improving the probability of obtaining high-yield strains of neomycin.

【技术实现步骤摘要】
一种可产新霉素的弗氏链霉菌株的高通量筛选方法
本专利技术属于微生物培养
，具体涉及一种可产新霉素的弗氏链霉菌株的高通量筛选方法。
技术介绍
硫酸新霉素是由弗氏链霉菌经发酵提取产生的一种氨基糖苷类抗生素，可以抑制蛋白质的生物合成，从而起到抑杀细菌的作用。对革兰氏阴性菌和部分革兰氏阳性菌有强效的杀菌作用；对放线菌、钩端螺旋体、阿米巴原虫有抑制作用。常用于治疗和控制对硫酸新霉素敏感菌感染引起的肠炎、下痢、传染性鼻炎、呼吸道感染等疾病。以往用于生产新霉素的弗氏链霉菌菌株大多由传统的筛选方法获得，摇瓶培养，液相或生物法检测效价，存在投资高，筛选周期长，筛选量小，筛选方法单一，筛选效率低等缺点，因此新霉素的生产能力攀升较慢。近年来有紫外分光光度法在快速检测发酵液中庆大霉素浓度的方法中的应用以及酶标法在高通量筛选泰乐菌素中的应用等文章和专利的发表，在庆大霉素和泰乐霉素的产生菌的筛选上有所突破,中国专利CN106244458公开了一种泰乐菌素高产菌株的高通量筛选方法，但应用范围窄且筛选方法粗糙，在新霉素的菌种选育中尚未见有关快速简便的检测方法和高通量筛选的报道。
技术实现思路
本专利技术主要是解决现有技术所存在的问题，提供一种操作简单，周期短，筛选效率高的可产新霉素的弗氏链霉菌株的高通量筛选方法。本专利技术的上述技术问题主要是通过下述技术方案得以解决的：本专利技术提供一种可产新霉素的弗氏链霉菌株的高通量筛选方法，包括测试用的酶标板、酶标仪，筛选步骤如下：（1）将待筛选的新霉素弗氏链霉菌单菌落分别接种于装有斜面培养基和发酵培养基的孔板中培养，发酵培养结束发酵液经硫酸酸化至pH4.5-5.0，离心取上清液，用蒸馏水稀释至新霉素浓度为30～100u/ml（100倍）；（2）发酵稀释液与0.25%磷钨酸在酶标板上混合反应，生成沉淀物，可用排枪取稀释液150µl到已装有150µl0.25%磷钨酸96孔酶标板中，酶标仪测定OD630值，（3）用酶标仪测定沉淀物的OD值，依OD对应值对菌株进行复筛；（4）将待复筛的多孔板中斜面培养基上长出的对应的菌株的孢子同时接种于大试管斜面或茄子瓶斜面和摇瓶发酵培养，发酵摇瓶培养结束后，发酵液用硫酸酸化至pH为4.5-5.0；（5）酸化液经过滤，将滤液稀释至30～100u/ml（150倍），然后取稀释液150µl到已装有150µl0.25%磷钨酸的96孔酶标板中，酶标仪测定OD630值，根据y=712.79×(x-空白)+8.0269（其中y为稀释后样品中新霉素浓度u/ml,x为稀释后样品OD630,空白为水加发酵滤液的OD630）计算得到样品新霉素浓度。进而根据稀释倍数换算得到发酵滤液中新霉素浓度，通过比较发酵滤液中新霉素浓度的高低即得到对应的产新霉素相对较高的菌株；（6）选出的菌株由大试管斜面或茄子瓶斜面制备成沙土管，由沙土管传出斜面经摇瓶发酵精筛，测定生物效价。作为优选，所述单菌落由出发菌单孢子悬液，经诱变和稀释后涂平板而取得，诱变采用紫外线、超声波或亚硝基胍等。作为优选，所述步骤（1）用无菌竹签挑取单菌落孢子传至装有斜面培养基的多孔板中，多孔板为24孔板或48孔板，培养温度28±1℃，湿度40%±5％，恒温恒湿培养时间10-12天。作为优选，所述斜面培养基为高氏1号培养基。作为优选，所述步骤（1）用无菌竹签挑取适量单菌落孢子传至装有发酵培养基的多孔板中，多孔板为24孔，微孔板震荡孵化器震荡培养，培养温度35℃±1℃，培养时间4-6天。作为优选，所述步骤（1）的发酵培养液中含有：淀粉7.0g/100ml,葡萄糖2.0g/100ml,棉籽蛋白粉2.0g/100ml,玉米浆3.0g/100ml,硫酸铵1.5g/100ml,蛋白胨1.0g/100ml,硫酸镁0.1%g/100ml,磷酸二氢钾0.05%g/100ml,轻质碳酸钙0.3g/100ml。作为优选，所述步骤（1）和（4）的发酵液用25%硫酸酸化，振荡30分钟左右，pH值调至4.5-5。离心是用高通量孔板自动平衡离心机，转速4000r/min，离心15分钟。大试管斜面的培养是在温度28℃，湿度40%的条件下培养10-12天。发酵摇瓶培养基的培养是在温度35℃，湿度45%的条件下培养6天。作为优选，所述步骤（3）和（5）酶标仪中设定检测波长为630nm测定OD值。y=712.79×(x-空白)+8.0269标准曲线的制备是将新霉素标准品分别配制成10u/ml、20u/ml、30u/ml、40u/ml、50u/ml、60u/ml、70u/ml、80u/ml、90u/ml和100u/ml的硫酸新霉素标准品溶液，吸取150µl蒸馏水及稀释液到装有150µl磷钨酸的酶标板中混匀，用酶标仪测其OD630，根据最小二乘法由OD630及新霉素浓度即得线性方程。本专利技术的带来的有益效果是：本专利技术是利用磷钨酸与氨基糖甙类抗生素可反应生成白色沉淀的原理用一定浓度的过量的磷钨酸与适当稀释倍数的新霉素发酵滤液反应，生成白色沉淀，依据新霉素浓度高低产生的白色沉淀多少而在一定波长的可见光处吸收的高低用酶标仪检测法来检测OD值，进而判断相应菌株产抗能力的高低，并结合多孔板斜面和多孔板发酵的培养而使新霉素的高通量筛选成为可能，形成了一整套的高通量筛选模型。该模型具有快速、大量、操作便捷、准确等特点，很大程度上提高了新霉素诱变育种的筛选效率，使获得新霉素高产菌株的几率大大提高。附图说明附图1是本专利技术可产新霉素的弗氏链霉菌株的高通量筛选流程示意图；附图2是新霉素浓度(μ/ml)对OD值曲线图。具体实施方式下面通过实施例，并结合附图，对本专利技术的技术方案作进一步具体的说明。将已经过紫外复合超声波诱变处理后的单孢子悬液长成的单菌落，用无菌竹签挑取适量孢子传至装有斜面培养基和发酵培养基的多孔板中培养，斜面为24孔板或48孔板，培养温度28±1℃，湿度40%±5％，恒温恒湿培养时间10天；发酵多孔板为24孔，培养温度35℃±1℃，湿度45%±5％，培养时间4天。培养完成后每个多孔板发酵液里滴1滴25%硫酸再次振荡30min使其充分酸化，酸化后在多孔板专用离心机上离心，4000rpm，15min。取上清液先稀释100倍。酶标板中加入150µl0.25%的磷钨酸，再加入150µl稀释100倍的发酵滤液，混匀，使之充分反应30分钟，将酶标板放入酶标仪中设定检测波长为630nm，测其OD值。根据测得OD值与生物效价的线性对应关系选择OD值高的菌株也就是产抗能力强的菌株进行复筛。表1为初筛测得的OD值表。（节选，因高通量筛选每批可达千位数以上）表1初筛测得的OD值表挑选6、9等号菌株进行复筛。酶标仪检测新霉素标准品与磷钨酸反应生成沉淀的OD值制备新霉素浓度对OD值标准曲线：用磷钨酸比色法制备标准曲线，称取一定量的新霉素标准品，稀释成不同浓度的标准溶液，将各浓度标准溶液150μl在酶标板中与150μl0.25％磷钨酸反应30分钟，生成乳白色沉淀，在630nm处测其OD值，将新霉素浓度对应OD值生成标准曲线，并回归出方程:y＝712.79×(样品OD-空白OD)+8.0269，R2＝0.9992。附图2是新霉素浓度(μ/ml)对OD值曲线图。Y：新霉素浓度即生物效价u/mlX：样品OD值减空白OD值根本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种可产新霉素的弗氏链霉菌株的高通量筛选方法，包括测试用的酶标板、酶标仪，其特征在于筛选步骤如下：（1）将待筛选的新霉素弗氏链霉菌单菌落孢子分别接种于装有斜面培养基和发酵培养基的多孔板中培养，发酵培养结束发酵液经硫酸酸化，离心取上清液，用水稀释；（2）发酵稀释液与0.25%磷钨酸在酶标板上混合反应，生成沉淀物；（3）用酶标仪测定沉淀物的OD值，依OD对应值对菌株进行复筛；（4）将待复筛的步骤（1）所述的多孔板斜面中的菌株的孢子分别接种于大试管斜面或茄子瓶斜面和摇瓶发酵培养，发酵摇瓶培养结束后，发酵液用硫酸酸化；（5）酸化液经过滤，将滤液稀释至30～100u/ml，取稀释液与0.25%磷钨酸在酶标板中反应，然后用酶标仪测定OD值，选出OD值相对较高的菌株；（6）选出的菌株由步骤（4）所述的大试管斜面或茄子瓶斜面制备成沙土管，经沙土管传斜面，接摇瓶发酵进行精筛，测定生物效价，得高产菌株。

【技术特征摘要】
1.一种可产新霉素的弗氏链霉菌株的高通量筛选方法，包括测试用的酶标板、酶标仪，其特征在于筛选步骤如下：（1）将待筛选的新霉素弗氏链霉菌单菌落孢子分别接种于装有斜面培养基和发酵培养基的多孔板中培养，发酵培养结束发酵液经硫酸酸化，离心取上清液，用水稀释；（2）发酵稀释液与0.25%磷钨酸在酶标板上混合反应，生成沉淀物；（3）用酶标仪测定沉淀物的OD值，依OD对应值对菌株进行复筛；（4）将待复筛的步骤（1）所述的多孔板斜面中的菌株的孢子分别接种于大试管斜面或茄子瓶斜面和摇瓶发酵培养，发酵摇瓶培养结束后，发酵液用硫酸酸化；（5）酸化液经过滤，将滤液稀释至30～100u/ml，取稀释液与0.25%磷钨酸在酶标板中反应，然后用酶标仪测定OD值，选出OD值相对较高的菌株；（6）选出的菌株由步骤（4）所述的大试管斜面或茄子瓶斜面制备成沙土管，经沙土管传斜面，接摇瓶发酵进行精筛，测定生物效价，得高产菌株。2.根据权利要求1所述的可产新霉素的弗氏链霉菌株的高通量筛选方法，其特征在于所述单菌落由出发菌单孢子悬液，经诱变和稀释后涂平板而取得，诱变采用紫外线、超声波或亚硝基胍。3.根据权利要求1或2所述的可产新霉素的弗氏链霉菌株的高通量筛选方法，其特征在于所述步骤（1）用无菌竹签挑取单菌落孢子传至装有斜面培养基的多孔板中，多...

【专利技术属性】
技术研发人员：不公告发明人，
申请(专利权)人：浙江浙大阳光科技有限公司，新疆天富阳光生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33