小麦中基因编辑效率的优化制造技术

本申请涉及基因编辑领域，特别地涉及小麦中的基因编辑。本申请提高了小麦中的基因编辑效率。

Optimization of Gene Editing Efficiency in Wheat

This application relates to the field of gene editing, in particular to gene editing in wheat. This application improves the efficiency of gene editing in wheat.

【技术实现步骤摘要】
小麦中基因编辑效率的优化
本申请涉及基因编辑领域，特别地涉及小麦中的基因编辑。本申请提高了小麦中的基因编辑效率。
技术介绍
小麦是世界上主要的粮食作物，具有重要的经济地位。从染色体和基因组分析，小麦具有比玉米、水稻等作物更为复杂的特征。首先，小麦是异源六倍体，具有三套染色体组(AABBDD)；其次，小麦基因组为大约17Gb。而玉米和水稻均为二倍体(AA)，基因组比小麦要小很多，玉米基因组为2.5Gb，水稻基因组仅为430Mb。同时小麦基因组具有更多的重复序列和可转座原件。这些特性在一定程度上增加了小麦基因组改良的难度[1]。成簇的规律间隔的短回文重复序列及其相关系统(CRISPR/Cassystem,ClusteredRegularlyInterspacedShortPalindromicRepeats/CRISPRassociated)是细菌和古细菌中的免疫系统，主要功能是抵抗入侵的病毒及外源DNA。其中CRISPR由一系列高度保守的重复序列(Repeat)与间隔序列(Spacer)相间排列组成，在体内被转录为长的RNA前体(pre-crRNA)；在CRISPR序列附近存在高度保守CRISPR相关基因(CRISPR-associatedgene，Casgene)，这些基因编码的蛋白具有核酸酶功能，可以对DNA序列进行特异性切割，产生DNA的双链断裂DSB(doublestrandedbreak)；pre-crRNA转录的同时，与其重复序列互补的反式激活crRNA(Trans-activatingcrRNA，tracrRNA)也转录出来。2012年，Jennifer实验室首次阐明了化脓链球菌(Streptococcuspyogenes)SF370中Class2,typeIICRISPR/Cas9系统的作用机理[2]。细菌中，pre-crRNA、tracrRNA和Cas9形成三元复合体，在其他酶的共同作用下，最终会形成多个成熟的复合体，每个复合体包含crRNA、tracrRNA和Cas9蛋白。crRNA是由一个间隔区和一段高度保守的重复序列组成，间隔区是可变的，大约20个核苷酸，可以根据目标基因进行设计，通过该间隔区和外源DNA互补配对，从而促使三元复合体发挥功能。进一步的优化表明，crRNA和tracrRNA可以连接形成一个嵌合的RNA分子，称为sgRNA(singleguidedRNA)，sgRNA在体外和Cas9蛋白形成有活性的二元复合体(sgRNA/Cas9)，造成目标DNA的断裂，大大简化了该系统的应用。2013年两篇文章相继报道了CRISPR/Cas9系统作为基因编辑的工具在哺乳细胞的应用[3],[4]，随后CRISPR/Cas9系统被广泛应用于各种生物体的基因编辑，成为第三代基因编辑的工具。在农业生物技术方面，CRISPR/Cas9广泛应用于各种农作物基因的改良。目前被报道的农作物包括玉米、水稻、大豆和小麦等[5],[6],[7],[8],[9],[10],[11],[12],[13],[14],[15],[16],[17]。在实际应用中，CRISPR/Cas9都是基于优化的单分子导向RNA(sgRNA)进行设计[27]。目前，在单子叶作物中，如玉米和水稻，Cas9基因一般是由来自于花椰菜花叶病毒(CaMV)的35S启动子驱动，或者是来自于玉米多聚泛素蛋白基因的启动子ZmUbi驱动；sgRNA一般是由细胞核内小RNA(snRNA)的启动子驱动，通常是产生U3或U6snRNA的启动子，简称U3或U6启动子，目前水稻和玉米来源的U3和U6被广泛应用于单子叶作物的编辑。根据发表的数据，CRISPR/Cas9系统以DNA的形式转化外植体，在筛选标记阳性的T0代玉米中，不同目标基因的编辑效率(编辑的植株数目/筛选标记阳性的植株数目)从60％到98％不等，大部分目标基因的编辑效率在80％以上[6],[18]。在水稻的研究中，也取得了类似甚至更高的编辑效率。目前，由于小麦基因组的复杂性，对小麦基因编辑的研究相对较少。大部分发表的文章来自于少数几个实验室。2013年高彩霞实验室首次报道[28]，采用35S启动子驱动水稻密码子优化的SpCas9，小麦U6启动子驱动sgRNA，在小麦原生质体中实现了对TaMLO基因的编辑。2014年报道[19]，采用玉米ZmUbi启动子驱动水稻密码子优化的spCas9，小麦U6启动子驱动sgRNA，获得了TaMLO基因突变的T0代植株，编辑效率为5.6％；在随后的报道中，高彩霞实验室一般采用在转化过程中不添加任何筛选试剂，即不筛选转化植株，直接从再生出来的植株中检测目标基因发生突变的植株。采用突变植株的数目对比起始转化的外植体的数目，即突变频率来衡量CRISPR/Cas9系统的有效性。目前，CRISPR/Cas9系统以DNA的形式转化外植体，不同突变位点的突变频率一般在1.0％到9.5％，大部分位点的突变频率在2.0％左右[20]。另一个对小麦研究的是美国的DanielF.Voytas实验室，采用小麦的原生质体进行CRISPR/Cas9系统的优化[21],[22]。在低筋小麦的研究中，采用CRISPR/Cas9对相应的基因进行片段缺失突变，获得21株转基因的T0植物，并没有报道T0代植株基因突变的结果，而是在T1代的植株进行目标基因的突变分析[23]，这可能和小麦中低的编辑效率有关。另外，就目前我们所查阅到的所有对小麦编辑的文章中，sgRNA都由小麦内源TaU6启动子驱动，还没有使用小麦内源TaU3的启动子的报道；Cas9基因在早期的文章中使用35S启动子驱动，最近的文章大多用玉米ZmUbi启动子驱动，这种改变主要是由于玉米ZmUbi启动子在小麦未成熟胚中表达更稳定和高效。然而基因编辑效率仍然不尽人意。和其他单子叶作物玉米和水稻相比，CRISPR/Cas9系统在小麦中产生的编辑效率偏低，还需要进一步提高编辑效率；目前没有报道用小麦U3的启动子驱动sgRNA进行基因编辑的研究，需要评估小麦U3启动子表达的sgRNA的活性，这样在设计多位点编辑的sgRNA中，可以有更多的选择，降低在同一个载体上多次使用同一个启动子引起载体不稳定的风险。
技术实现思路
在一个方面，本专利技术涉及一种表达盒，其包含与植物内源高表达启动子有效连接的Cas9基因，以及添加在所述植物内源高表达启动子前面的有效连接的增强子。在此处所述的“有效连接”意指，所连接的相关元件能够有效地发挥各自的相关功能或活性。优选地，所述植物内源高表达启动子为植物泛素启动子或植物肌动蛋白启动子。更优选地，所述植物泛素启动子为玉米泛素启动子prZmUbi1、甘蔗泛素启动子prSoUbi4或二穗短柄草泛素启动子prBdUbi10。更优选地，所述玉米泛素启动子prZmUbi1的序列如SEQIDNO:4所示；所述甘蔗泛素启动子prSoUbi4的序列如SEQIDNO:5所示；所述二穗短柄草泛素启动子prBdUbi10的序列如SEQIDNO:6所示。更优选地，所述植物肌动蛋白启动子为水稻肌动蛋白启动子prOsAct1。更优选地，所述水稻肌动蛋白启动子prOsAct1的序列如SEQIDNO:20所示。优选地，所述增强子为植物病毒来源的增本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种表达盒，其包含与植物内源高表达启动子有效连接的Cas9基因，以及添加在所述植物内源高表达启动子前面的有效连接的增强子。

【技术特征摘要】
1.一种表达盒，其包含与植物内源高表达启动子有效连接的Cas9基因，以及添加在所述植物内源高表达启动子前面的有效连接的增强子。2.根据权利要求1所述的表达盒，其中所述植物内源高表达启动子为植物泛素启动子或植物肌动蛋白启动子。3.根据权利要求2所述的表达盒，其中所述植物泛素启动子为玉米泛素启动子prZmUbi1、甘蔗泛素启动子prSoUbi4或二穗短柄草泛素启动子prBdUbi10。4.根据权利要求3所述的表达盒，其中所述玉米泛素启动子prZmUbi1的序列如SEQIDNO:4所示。5.根据权利要求3所述的表达盒，其中所述甘蔗泛素启动子prSoUbi4的序列如SEQIDNO:5所示。6.根据权利要求3所述的表达盒，其中所述二穗短柄草泛素启动子prBdUbi10的序列如SEQIDNO:6所示。7.根据权利要求2所述的表达盒，其中所述植物肌动蛋白启动子为水稻肌动蛋白启动子prOsAct1。8.根据权利要求7所述的表达盒，其中所述水稻肌动蛋白启动子prOsAct1的序列如SEQIDNO:20所示。9.根据权利要求1-8中任一项所述的表达盒，其中所述增强子为植物病毒来源的增强子。10.根据权利要求9所述的表达盒，其中所述植物病毒来源的增强子为玄参花叶病毒FMV增强子、花椰菜花叶病毒CaMV35S增强子或者玄参花叶病毒FMV增强子和花椰菜花叶病毒CaMV35S增强子这两者。11.根据权利要求10所述的表达盒，其中所述玄参花叶病毒FMV增强子的序列如SEQIDNO:1所示。12.根据权利要求10所述的表达盒，其中所述花椰菜花叶病毒CaMV35S增强子的序列如SEQIDNO:2所示。13.根据权利要求1-12中任一项所述的表达盒，其中所述Cas9基因的序列如SEQIDNO:7或8所示。14.一种表达盒，其包含与小麦U3启动子有效连接的编码sgRNA的DNA序列。15.根据权利要求14所述的表达盒，其中所述小麦U3启动子的序列如SEQIDNO:13所示。16.根据权利要求14或15所述的表达盒，其中所述编码sgRNA的DNA序列如SEQIDNO:16、17、18或19所示。17.一种表达载体，其包含根据权利要求1-13中任一项所述的表达盒，或者包含根据权利要求14-16中任一项所述的表达盒，或者包含根据权利要求1-13中任一项所述的表达盒和根据权利要求14-16中任一项所述的表达盒。18.一种细胞，其包含根据权利要求17所述的表达载体。19...

【专利技术属性】
技术研发人员：耿立召，许建平，
申请(专利权)人：先正达参股股份有限公司，先正达生物科技中国有限公司，
类型：发明
国别省市：瑞士,CH