一种基于毒性解毒基因创制智能不育系的方法技术

本发明专利技术公开了一种基于毒性解毒基因创制作物智能不育系的方法。本发明专利技术以不育材料为研究对象，包括雄性不育材料和雌性不育材料，利用基因沉默技术，对野生型解毒基因进行操作，使解毒基因沉默。将解毒基因沉默、育性恢复基因和筛选标记基因3个连锁的表达盒构建载体，通过转基因技术转入隐性细胞核雄性/雌性不育系。获得智能雄性/雌性不育系，应用于雄性/雌性不育系的繁殖和杂交种的机械化制种。

A Method of Creating Intelligent Male Sterile Line Based on Toxicity Detoxification Gene

The invention discloses a method for producing an intelligent sterile line based on toxicity detoxification gene. The invention takes the sterile material as the research object, including the male sterile material and the female sterile material, and uses gene silencing technology to operate the wild type detoxification gene to silence the detoxification gene. Vectors were constructed by three linkage expression boxes of detoxification gene silencing, fertility restoration gene and screening marker gene, and were transferred into recessive nuclear male/female sterile lines by transgenic technology. Intelligent male/female sterile lines were obtained and applied to reproduction of male/female sterile lines and mechanized seed production of hybrids.

【技术实现步骤摘要】
一种基于毒性解毒基因创制智能不育系的方法
本专利技术属于植物分子生物学和农业
，具体地涉及一种创制智能不育系的方法，更具体地涉基于毒性解毒基因在智能不育系中的应用。
技术介绍
杂种优势利用是现代农业生产中的一个重大技术突破与成果。杂交所产生的杂种优势是指两个有遗传基础差异的亲本的杂交后代在多种形状上优于两亲本的现象。发展和利用可以控制的授粉系统是杂种优势利用发展的关键。以不育系为基础的杂种优势利用技术已经在水稻、玉米、小麦等农作物中广泛的应用。雄性不育系以不育基因的遗传方式和在细胞中的定位可分为细胞核雄性不育系和细胞质雄性不育系以及核质互作不育系。而雌性不育表型多种多样，不育机理较为复杂，比较典型的植物雌性不育特征如子房干瘪、种子发芽率低和无花柱和柱+头等。科学家们发现并鉴定出了众多不育基因，如PAIR2、UDT1、OsGAMYB、OsFMS2和PTB1等，这让直接在分子层面上利用不育基因成为了可能。随着现代生物科学技术的不断发展，将遗传稳定的不育基因利用起来，保持和繁殖不育系，并最终生产不含转基因成分的不育系和杂交种成为了杂交水稻发展新的重要方向。与传统杂交育种和常规转基因育种相比，智能不育系技术有着如下优势：1.所利用不育基因是农作物普遍存在，可以将所有遗传背景的农作物都创制成智能不育系，资源利用率超过95％，这解决了常规育种传统的常规杂交育种存在着资源利用率低、育种周期长等瓶颈问题。2.被转入的基因被限制，不能传播到其它作物，杂交后代植株中也不含外源的转基因元件，不存在转基因生物安全问题。近年来，智能不育系技术正刚刚起步并迅速发展，已有玉米多控不育技术、美国杜邦先锋的SRT技术、水稻智能不育技术等。玉米多控不育技术以玉米隐形核不育系为基础，建立了不受光温敏影响的玉米隐形核不育材料的有效繁殖技术体系。玉米SRT技术综合利用了转基因技术、花粉败育技术和荧光蛋白色选技术，恢复不育系的育性并能有效繁殖。而水稻智能不育技术借鉴了玉米SRT技术，实现了用转基因手段生产非转基因的不育系种子和杂交稻种子。所以新的可用于智能不育系创制的育性恢复、花粉败育、筛选标记3种遗传工具的的发现和更新，成为了智能不育系研究的重要方向。近年来水稻远缘杂种不育分子机理及应用有了较大的突破，发现了如qHMS7位点的毒性基因ORF2/解毒基因ORF3等通过毒性-解毒机制导致作物育性改变的基因位点。这些基因通过控制雌雄配子的发育和功能影响植株育性。这类影响远缘杂交育性的关键基因在远缘杂交不育分子机理研究上有重大理论研究意义的同时，在智能不育系的应用中也有着广阔的空间和巨大的潜力。
技术实现思路
本专利技术旨在克服现有技术的不足，提供一种基于毒性解毒基因创制作物智能不育系的方法。为了达到上述目的，本专利技术提供的技术方案为：所述基于毒性解毒基因创制作物智能不育系的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：利用基因工程手段使解毒基因沉默；将解毒基因沉默表达盒、育性恢复基因表达盒和筛选标记基因表达盒3个连锁的表达盒构建载体，通过转基因技术转入作物隐性细胞核雄性或雌性不育系，获得智能雄性或雌性不育系，应用于作物雄性或雌性不育性的繁殖和作物杂交种的机械化制种。优选地，所述解毒基因包括但不限于qHMS7位点的ORF3基因，所述解毒基因序列如SEQIDNO.1所示。所述育性恢复基因包括但不限于野生型雄性不育或雌性不育基因。所述筛选标记基因包括但不限于荧光标记基因、颖壳颜色基因等。5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，基因沉默方法包括但不限于反义技术、RNA干扰等。优选地，所述应用于作物雄性或雌性不育性的繁殖是用于作物隐性细胞核雄性或雌性不育系的繁殖。所述应用于作物杂交种的机械化制种是用于利用雌性不育的作物杂交种的机械化制种。所述作物为单子叶作物或双子叶作物，所述单子叶作物或双子叶作物包括但不限于水稻、玉米、油菜、谷子、小麦、辣椒等。下面对本专利技术作进一步说明：本专利技术提供了一种基于毒性解毒基因创制智能不育系的方法：(1)将解毒基因沉默表达盒、育性恢复基因表达盒、筛选标记基因表达盒插入水稻表达载体；(2)将步骤1所制备的构建体转入雄性不育/雌性不育材料，产生第一植株；(3)第一植株自花授粉，产生的后代中，一半为不含外源构建体的纯合隐性雄性/雌性不育植株，另一半为含有外源构建体的第一植株。步骤1所述的外源构建体包含：a)第一核苷酸序列，当其表达时，会抑制含有该核苷酸序列的雄性配子的形成或功能；b)第二核苷酸序列，其包含突变后会导致植株花粉不育或雌性不育的核苷酸序列，当在不育植株中表达时其将恢复所述植株的正常花粉或雌性器官发育；c)第三核苷酸序列，当其表达时，可区分植株中是否含有引入的构建体。在本专利技术中，上述创制智能不育系的方法中所提到的第一核苷酸序列为解毒基因沉默，序列如SEQIDNO.1所示，其中解毒基因包括但不限于qHMS7位点的ORF3基因。所述的第一核苷酸序列与第四核苷酸序列可操作的相连，所述第四核苷酸序列偏好于在植物花粉中表达。在本专利技术中，上述创制智能不育系的方法中所提到的第二核苷酸序列为育性恢复基因，包括但不限于雄性或雌性不育基因的野生型。所述的第二核苷酸序列与第五核苷酸序列可操作的相连，所述第五核苷酸序列偏好于在植物雄性或雌性器官中表达。在本专利技术中，上述创制智能不育系的方法中所提到的第三核苷酸序列为荧光蛋白基因、颖壳颜色等基因构成的组之一。其中所述的第三核苷酸序列与第六核苷酸序列可操作的相连，所述第六核苷酸序列为END2或LTP2等在愈伤组织/种子或胚乳中特异表达的启动子。在本专利技术中，上述创制智能不育系的方法中所提到的第二核苷酸序列至第六核苷酸序列已于专利技术专利公开(专利号：ZL201410116096.8)。本专利技术还提供了一种新的替代花粉败育基因的方法，所述方法包括对如qHMS7等通过毒性解毒机制调控花粉功能的基因，通过突变的技术手段使得花粉败育。所述“突变”包括但不限于以下方法，如用反义RNA、RNAi等基因沉默手段产生。在本专利技术中，所述解毒基因沉默包括但不限于qHMS7位点的解毒基因ORF3沉默。举例而言，目前已经发现某些水稻品种同时携带有毒的ORF2和解毒的ORF3，花粉因有ORF3的保护而存活，缺乏ORF3的保护，花粉将死亡，从而表现雄性不育。本专利技术所述的第一核苷酸序列为利用上述方法使花粉败育的核苷酸序列，所述序列如SEQIDNO.1所示。第一核苷酸序列可被构建成表达盒插入转化进细胞中的任何载体中。扩增上述核苷酸片段的全长或任意片段的引物对也是本专利技术保护的范围。含有第一核苷酸片段的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也是本专利技术的保护范围。优选的细胞是作物细胞，优选是水稻细胞。所述作物细胞中包含的本专利技术第一核苷酸可以是通过转基因技术导入植物细胞的，包括导入到植物细胞的核、叶绿体、线粒体和/或质体中，使得本专利技术第一核苷酸存在于植物细胞中的。本专利技术还提供了一种繁殖纯合隐性核雄性/雌性不育系的方法，所述方法包括：(1)将解毒基因沉默表达盒、育性恢复基因表达盒、筛选标记基因表达盒插入水稻表达载体；(2)将步骤1所制备的构建体转入雄性不育/雌性不育材料，产生第一植株；(3)第一植株自花授粉，产生的后代中，一半为不含外源构建体的纯合隐性雄性/本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于毒性解毒基因创制作物智能不育系的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：利用基因工程手段使解毒基因沉默；将解毒基因沉默表达盒、育性恢复基因表达盒和筛选标记基因表达盒3个连锁的表达盒构建载体，通过转基因技术转入作物隐性细胞核雄性或雌性不育系，获得智能雄性或雌性不育系，应用于作物雄性或雌性不育性的繁殖和作物杂交种的机械化制种。

【技术特征摘要】
1.一种基于毒性解毒基因创制作物智能不育系的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：利用基因工程手段使解毒基因沉默；将解毒基因沉默表达盒、育性恢复基因表达盒和筛选标记基因表达盒3个连锁的表达盒构建载体，通过转基因技术转入作物隐性细胞核雄性或雌性不育系，获得智能雄性或雌性不育系，应用于作物雄性或雌性不育性的繁殖和作物杂交种的机械化制种。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述解毒基因包括但不限于qHMS7位点的ORF3基因，所述解毒基因序列如SEQIDNO.1所示。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述育性恢复基因包括但不限于野生型雄性不育或雌性不育基因。4.如权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹孟良，夏玉梅，唐宁，李丁，卜小兰，余木兰，
申请(专利权)人：湖南杂交水稻研究中心，
类型：发明
国别省市：湖南,43