一种基因编辑技术打靶Ghd7基因提早水稻抽穗的方法技术

鉴于不同稻种质跨区域种植带来的育种难题和育种机遇，本发明专利技术提供了一种基因编辑技术打靶Ghd7基因提早水稻抽穗的方法。同时提供一种利用Cas9基因组编辑技术靶向水稻Ghd7基因的第一外显子，快速地获得水稻早花突变体材料。通过该方法我们成功的获得了能提早抽穗20多天的水稻秀水134改良品种。该发明专利技术可以创制环境适应性更为广阔的新种质，也为南方籼稻米质改良及优势籼稻北移的育种思路提供一种高效的可操作方式。

【技术实现步骤摘要】
一种基因编辑技术打靶Ghd7基因提早水稻抽穗的方法
本专利技术涉及水稻分子育种领域，尤其涉及一种基因编辑技术打靶Ghd7基因提早水稻抽穗的方法。
技术介绍
我国水稻种植历史悠久，稻区种植面积辽阔，南到海南岛，北至黑龙江省，东至台湾省，西达新疆维吾尔自治区，均有水稻种植。据国家水稻数据中心统计，自1984年以来，农业部功审定937各品种，但是由于各地自然生态环境和水稻种质资源的明显差异，不同的品种只能种植于特定的维度区域，长期以来逐渐形成我国南籼北粳的稻作方式。籼稻品种普遍具米质较好，经济效应高，缺点是抗病性差。南方籼稻却相反，具有抗病性强的特性但米质较差，经济效应低。显然区域的限制阻碍了优良种质资源的交流和优质水稻品种的种植面积。特别是部分稻瘟病抵抗性较强的籼稻，如果能成功的适当北移到长江以北黄河以南区域特有的光温环境下，一方面有助于探讨北方水稻抗病能力，另一方面对南方籼稻米质的改良也是一种有益的探索。Ghd7基因编码一种含CCT结构域的水稻抽穗调控蛋白，其表达和功能严格受日照长短调控，研究表明，在长日条件下，该基因的表达增强，可以推迟抽穗，而功能减弱的自然突变体能够提早开花，说明该基因是一个长日照条件下的开花抑制因子。可见，该基因可以用来解决南籼北种开花延迟带来的地域限制，对优良籼稻资源的适应性、品种多样性和水稻种质资源交流和互补方面有重要的作用。基于以上背景，本专利技术的出发点是提出一种南籼北种的新思路，同时提供一种简便有力的实施方式，即利用CAS9基因组编辑技术对水稻Ghd7基因的第一外显子进行定点编辑，快速地获得不同突变类型的Ghd7突变体，并从中筛选出能提早抽穗的突变体材料，创制环境适应性更为广阔的新种质。
技术实现思路
基于
技术介绍
，本专利技术提供了一种探讨水稻南籼北种思路。并提出了一种以CRISPR/Cas9基因编辑技术创制Ghd7基因突变体来改良水稻抽穗的方法。最终获得早花水稻品种，克服了南籼北种带来开花延迟问题。该专利技术适应于所有含有功能型Ghd7基因的水稻品种中。为实现上述目的，采用以下技术方案：方法包括以下步骤：（1）拟改良水稻品种Ghd7基因的序列分析确定基因突变类型，选择该基因的第一外显子位置处为靶点；（2）构建打靶载体，将拟改良水稻品种的愈伤组织作为遗传转化的受体材料，用农杆菌介导法将打靶载体导入愈伤组织细胞；（3）对Ghd7基因编辑体的基因型检测及选取移码突变的基因型进行表型考察，考察抽穗期变化情况。具体为：（1）水稻中Ghd7基因型的检测；（2）水稻中Ghd7基因CRISPR/Cas9敲除表达载体的构建；（3）将粳稻秀水134作为遗传转化的受体材料，鉴定转基因阳性植株，检测目的基因编辑情况，获得不同突变类型的Ghd7等位基因，考察纯合突变体的表型和抽穗期，最终获得抽穗期改良品系。所述Ghd7基因为编码Ghd7蛋白的基因。所述Ghd7基因编码的Ghd7蛋白为：(1)由序列表中SEQIDNO.3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或(2)将SEQIDNO.3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的其衍生的蛋白质。所述Ghd7基因为：1)编码区如序列表中SEQIDNO.1所示的DNA分子；或2)序列表中SEQIDNO.2所示的DNA分子；或3)与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码Ghd7蛋白的DNA分子；或4)与1)或2)限定的DNA序列至少具有70％以上同源性且编码所述Ghd7功能蛋白的DNA分子。水稻中Ghd7基因的表达是通过对水稻中Ghd7基因进行基因编辑实现的。所述基因编辑是借助CRISPR/Cas9系统实现的。所述CRISPR/Cas9系统中，cas9蛋白的表达由Ubiquitin启动子启动，gRNA由U6启动子启动。打靶载体的gRNA靶标序列如下：ggagaaggatgtggcctgtg。所述gRNA的编码基因如序列表的SEQIDNO.1中第232-251位核苷酸所示，该序列靶定Ghd7等位基因的第1个外显子。与现在技术相比，本专利技术的有益成果在于：本专利技术提出了一种南籼北种的探索性思路，以期为水稻跨区域迁移和品质育种提供有益探索。同时借助基因编辑技术的运用，通过定向打靶功能基因Ghd7来实现突变体的获得，该方法该系统简单易行、成本更低、效率高。本专利技术利用基因组编辑技术对Ghd7基因功能的的定点编辑，成功的获得了能适当提早抽穗的粳稻品种。为水稻不同抽穗期新种质的创制及优势水稻特别是南粳北种的育种实践提供一种高效的可操作方式。附图说明图1水稻Ghd7基因的序列分析及基因编辑靶点设计图。其中，黑色方框表示外显子，黑色线条表示内含子，灰色方框表示Cas9识别序列，识别位点位于Ghd7基因第二外显子处。图2cas9介导的Ghd7不同基因型的获得。WT为野生型序列，阿拉伯数字表示发生缺失或增加的碱基数（数字前面加“-”表碱基缺失，数字前面加“+”表碱基增加），灰色字体为添加碱基。图3秀水134材料野生型和突变体在福州的抽穗期考察。图4秀水134材料野生型和突变体在福州的表型考察。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本专利技术，但并不限定本专利技术。下述实施例中所使用的实验验方法如没有特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所使用的的实验材料如无特别说明均为市售购买产品。实施例1：水稻Ghd7基因的序列分析及基因编辑靶点设计水稻Ghd7基因的序列如SEQIDNO.1所示。序列分析显示，该基因含有4个外显子，分别为序列表中第211-654（第一外显子）、第2300-2629（第二外显子）。本专利技术所设靶均在两个品种秀水134材料中Ghd7基因上的第1外显子232-251处的碱基。实施例2：打靶载体构建及水稻遗传转化本实验采用购于北京唯尚立德生物科技有限公司的骨架载体pCXUN-Cas9，包含人工合成的cas9蛋白序列、驱动cas9蛋白的Ubiquitin启动子驱动和驱动gRNA的U6启动子。gRNA片段由公司合成并通过DNA连接酶连接在U6启动子之后形成重组质粒pCXUN-Cas9-gRNA（环形载体）。其中，gRNA序列如下：ggagaaggatgtggcctgtg。本专利技术中，带有所述载体pCXUN-Cas9-gRNA的农杆菌可以转化粳稻、籼稻和糯稻的愈伤组织，并经抗性愈伤的筛选、分化和生根获得转基因材料，具体步骤如下：1.取水稻成熟种子脱壳，挑选饱满光洁无菌斑的种子用70%酒精消毒1分钟，倒去酒精，加入100ml30%次氯酸钠溶液，浸泡30分钟；倒去次氯酸钠溶液，用无菌蒸馏水清洗种子4-5遍后，将消毒好种子放在无菌滤纸上吸干放置于诱导培养基中，在30℃光照培养箱，培养4周；待胚性愈伤组织（淡黄色，致密呈球状）长出将其移到新的诱导培养基中，继代培养2周。挑取单克隆的农杆菌涂布于YEP（含50mg/L卡那霉素和利福平）固体培养基中，28℃暗培养48h；待菌落长出，用AAM培养基（含有100μM·L-1乙酰丁香酮，pH5.2）洗菌，28℃，250rpm振荡培养36h至菌液OD600nm=1.8左右，获得农杆菌悬浮液。将长到一定大小的水稻愈伤组织挑出，放入农杆菌悬浮液侵染30分钟后将愈伤组织取出，置于无菌的滤纸上沥干40分钟；再将愈伤组织置于共培养基上(NB培养基本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基因编辑技术打靶Ghd7 基因提早水稻抽穗的方法，其特征包括如下步骤：（1）拟改良水稻品种Ghd7基因的序列分析确定基因突变类型，选择该基因的第一外显子位置处为靶点；（2）构建打靶载体，将拟改良水稻品种的愈伤组织作为遗传转化的受体材料，用农杆菌介导法将打靶载体导入愈伤组织细胞；（3）对Ghd7基因编辑体的基因型检测及选取移码突变的基因型进行表型考察，考察抽穗期变化情况。

【技术特征摘要】
1.一种基因编辑技术打靶Ghd7基因提早水稻抽穗的方法，其特征包括如下步骤：（1）拟改良水稻品种Ghd7基因的序列分析确定基因突变类型，选择该基因的第一外显子位置处为靶点；（2）构建打靶载体，将拟改良水稻品种的愈伤组织作为遗传转化的受体材料，用农杆菌介导法将打靶载体导入愈伤组织细胞；（3）对Ghd7基因编辑体的基因型检测及选取移码突变的基因型进行表型考察，考察抽穗期变化情况。2.根据权利要求1所述的一种基因编辑技术打靶Ghd7基因延长水稻抽穗的方法，其特征在于，Ghd7基...

【专利技术属性】
技术研发人员：王锋，朱义旺，林雅容，陈在杰，刘华清，陈建民，范美英，
申请(专利权)人：福建省农业科学院生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：福建,35