一种分离的核酸及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种分离的核酸及其应用，涉及生物分子技术领域。该核酸的碱基序列如(1)～(3)任一项所示：(1)碱基序列如SEQ ID NO.3所示；(2)第1～225位碱基序列如SEQ ID NO.1所示，第226～1737位碱基序列编码Env蛋白，Env蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；(3)第1～225位碱基序列编码M蛋白，第226～1737位碱基序列如SEQ ID NO.2所示，M蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。该核酸能够大量表达寨卡病毒的免疫抗原，有利于寨卡病毒疫苗或寨卡病毒治疗药物的研究。

A Separated Nucleic Acid and Its Application

The invention discloses a separated nucleic acid and its application, which relates to the field of biomolecular technology. The base sequence of the nucleic acid is as follows: (1) the base sequence is as shown in SEQ ID NO.3; (2) the base sequence at position 1-225 is as shown in SEQ ID NO.1, the base sequence at position 226-1737 encodes Env protein, and the amino acid sequence of Env protein is as shown in SEQ ID NO.4; (3) the base sequence at position 1-225 encodes M protein, and the base sequence at position 226-1737 encodes M protein as shown in SEQ ID NO.2. The amino acid sequence is shown in SEQ ID NO.5. The nucleic acid can express a large number of immune antigens of Zhaika virus, which is conducive to the research of Zhaika virus vaccine or therapeutic drugs for Zhaika virus.

【技术实现步骤摘要】
一种分离的核酸及其应用
本专利技术涉及生物分子
，具体而言，涉及一种分离的核酸及其应用。
技术介绍
寨卡病毒(Zikavirus)于1947年首次在非洲乌干达寨卡森林发现，其寄生于恒河猴体内，主要通过蚊虫叮咬传播。目前约有80％的寨卡病毒感染个体并未表现出明显的临床症状，少数有临床症状的感染个体表现为发热、皮疹、关节痛、肌肉痛、头痛、呕吐和眼结膜炎，这些临床症状通常会持续1周以上且表现较为温和。寨卡病毒传播媒介是埃及伊蚊和白纹伊蚊，它们全年活跃在世界许多地方,包括美国南部沿海大多数州及拉丁美洲和太平洋许多度假区。寨卡病毒病除了提前预防外，尚无特效治疗方法。防止寨卡病毒感染的最有效保护方法就是防止蚊虫叮咬。但寨卡病毒能够经胎盘屏障由孕妇垂直传给胎儿，并给胎儿造成严重后果，如导致胎儿大脑结构异常，包括脑干和小脑发育不全、延迟髓鞘形成、脑室扩大、大脑薄壁组织严重钙化以及少数的无脑回症状。与其他感染孕妇并影响多种组织器官发育的病毒不同，寨卡病毒似乎只影响神经组织。研究证明46名孕妇在产期感染了寨卡病毒后，直接导致产婴的小头畸形症且大脑严重损害。而目前尚无商业化的寨卡病毒预防性疫苗和治疗性药物。
技术实现思路
本专利技术的第一目的在于提供一种分离的核酸，其能够大量表达寨卡病毒的免疫抗原，有利于寨卡病毒疫苗或寨卡病毒治疗药物的研究。本专利技术的第二目的在于提供一种载体，其包括有如上的核酸。本专利技术的第三目的在于提供一种重组腺病毒的构建方法。本专利技术的第四目的在于提供一种重组腺病毒，其由上述构建方法制得，能够表达大量复制并表达目的基因。本专利技术的第五目的在于提供一种重组细胞或重组菌，培养该重组细胞或重组菌能够得到高质量的寨卡病毒的免疫抗原，有利于寨卡病毒疫苗或寨卡病毒治疗药物的研究。本专利技术的第六目的在于提供一种制备Env蛋白的方法，其能够快速高效获得Env蛋白。本专利技术的第七目的在于提供一种寨卡病毒疫苗。本专利技术的第八目的在于提供分离的核酸、载体、或重组腺病毒在制备用于预防或治疗寨卡病毒感染的药物中的应用。本专利技术是这样实现的：一种分离的核酸，其碱基序列如(1)～(3)任一项：(1)如SEQIDNO.3所示；(2)第1-225位碱基序列如SEQIDNO.1所示，第226～1737位碱基序列编码Env蛋白，Env蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.4所示；(3)第1～225位碱基序列编码M蛋白，第226～1737位碱基序列如SEQIDNO.2所示，M蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.5所示。在本专利技术一些实施方式中，分离的核酸3’端连接有PolyA序列(多聚A)，和/或分离的核酸5’端连接有信号肽。PolyA序列可为SV40PolyA序列。信号肽可为信号肽Igκ。在本专利技术的一些实施方式，分离的核酸的碱基序列如SEQIDNO.6或7所示。一种载体，载体包括有如上的核酸。在本专利技术的一些实施方式中，上述载体为重组腺病毒载体。在本专利技术的优选实施例中，上述腺病毒载体可为5型腺病毒载体(rAd5)。在本专利技术的优选实施例中，上述5型腺病毒载体为pAd5-CMV/V5-DEST质粒载体。一种重组腺病毒载体的制备方法，其包括将包括有上述核酸的穿梭质粒载体与腺病毒载体接触，通过同源重组的方式将核酸转移至腺病毒载体上，以获得包含有上述核酸的重组腺病毒载体。在本专利技术的一些实施例中，上述穿梭质粒载体为pDONR221。在本专利技术的一些实施方式中，上述制备方法包括将测序正确的含有上述核酸的穿梭质粒载体(pDONR221-M-Env-PolyA)转化至包含腺病毒载体(pAd5-CMV/V5-DEST)的大肠杆菌TOP10感受态细胞进行同源重组，筛选测序正确的包含有上述核酸的重组腺病毒载体(pAd5-CMV-M-Env-PolyA)。一种重组腺病毒的构建方法，其包括将上述包含上述核酸的腺病毒载体转染宿主细胞。在本专利技术的优选实施例中，上述宿主细胞为293细胞。一种重组腺病毒，其由上述重组腺病毒的构建方法制得。一种重组细胞或重组菌，其包括有上述的核酸、或上述的载体或上述重组腺病毒。在本专利技术的一些实施方式中，的重组细胞为293细胞。一种制备Env蛋白的方法，其包括：培养如上的重组细胞或重组菌。一种寨卡病毒疫苗，其包含：上述分离的核酸、上述载体、上述重组腺病毒或上述制备方法制备得到的Env蛋白。本专利技术提供了一种上述分离的核酸在制备用于预防或治疗寨卡病毒感染的药物中的应用。本专利技术提供了一种上述载体在制备用于预防或治疗寨卡病毒感染的药物中的应用。本专利技术提供了一种上述重组腺病毒在制备用于预防或治疗寨卡病毒感染的药物中的应用。本专利技术具有以下有益效果：本专利技术提供的分离的核酸，其包括有优化重组的寨卡病毒基因序列，该序列具有极好的稳定性，能够大量表达寨卡病毒的免疫抗原，有利于寨卡病毒疫苗或寨卡病毒治疗药物的研究。本专利技术提供的包含上述分离的核酸的重组腺病毒及其构建方法，其将含有上述分离的核酸的重组腺病毒载体染进293细胞中，包装得到，该重组腺病毒的病毒液体免疫小鼠后可刺激机体产生很强的抗体滴度。培养本专利技术提供的重组细胞或重组菌可大量表达得到高质量的寨卡病毒的免疫抗原，有利于寨卡病毒疫苗或寨卡病毒治疗药物的研究。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本专利技术的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。图1为寨卡病毒基因组的示意图；图2为第一实施例中的载体pDONR221-M-Env-PolyA的菌落PCR检测结果图；图3为第一实施例中的PCR鉴定pAd5-CMV-M-Env-PolyA质粒的结果图；图4为第三实施例中的PCR扩增的M-Env片段结果图；图5为第三实施例中的基因优化前后的病毒液中重组腺病毒rAd5-M-Env-PolyA的WB的检测结果图；图6为第一对比例中纯化后的重组腺病毒rAd5-M-Env-PolyA的TEM检测结果；图7为第一对比例中纯化后的重组腺病毒rAd5-M-Env-PolyA的HPLC检测结果；图8为第一对比例中重组腺病毒的抗体滴度测试图；图9为第二对比例中WB检测基因优化前后重组rAd5-M-Env病毒Env蛋白表达图。具体实施方式为使本专利技术实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。下面对本专利技术实施例提供的分离的核酸及其应用进行具体说明。寨卡病毒全长基因组为单股正链RNA分子，序列全长约11000个核苷酸，该病毒属黄病毒科中黄病毒属。寨卡病毒全基因组共编码3419个氨基酸，病毒蛋白全长被分割成为几个功能结构域：核衣壳(Capsidregion，C区)、病毒膜前体(Precursorofmembraneregion，prM区)、包膜蛋白(Enveloperegion，E区)和7个非结构蛋白(non-structuralproteins，NS)区域，包括：NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和N本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种分离的核酸，其特征在于，其碱基序列如(1)～(3)任一项所述：(1)如SEQ ID NO.3所示；(2)第1‑225位碱基序列如SEQ ID NO.1所示，第226～1737位碱基序列编码Env蛋白，Env蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；(3)第1～225位碱基序列编码M蛋白，第226～1737位碱基序列如SEQ ID NO.2所示，M蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。

【技术特征摘要】
1.一种分离的核酸，其特征在于，其碱基序列如(1)～(3)任一项所述：(1)如SEQIDNO.3所示；(2)第1-225位碱基序列如SEQIDNO.1所示，第226～1737位碱基序列编码Env蛋白，Env蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.4所示；(3)第1～225位碱基序列编码M蛋白，第226～1737位碱基序列如SEQIDNO.2所示，M蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.5所示。2.根据权利要求1所述的分离的核酸，其特征在于，所述分离的核酸3’端连接有PolyA序列，和/或所述分离的核酸5’端连接有信号肽；所述PolyA序列优选为SV40PolyA序列；所述信号肽优选为信号肽Igκ。3.根据权利要求2所述的分离的核酸，其特征在于，所述分离的核酸的碱基序列如SEQIDNO.6或7所示。4.一种载体，其特征在于，所述载体包括有如权利要求1～3任一项所述的核酸的碱基序列；优选地，所述载体为腺病毒载体；进一步优选地，所述腺病毒载体为5型腺病毒载体；更进一步优选地，所...

【专利技术属性】
技术研发人员：谌章舟，慕婷，赵萍，董威，
申请(专利权)人：武汉博沃生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北,42