鸡传染性法氏囊病病毒VP2基因、其表达产物、其亚单位疫苗及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种鸡传染性法氏囊病病毒VP2基因、其表达产物、其亚单位疫苗及应用。本发明专利技术提供了一种鸡传染性法氏囊病病毒VP2基因的核酸序列、克隆该核酸序列的引物、含该核酸序列的表达载体、由表达载体转化而得的工程菌、由核酸序列编码、表达载体表达或所工程菌分离的鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白，及鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白自组装而成的鸡传染性法氏囊病毒病毒样颗粒。还提供了由鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白制得的亚单位疫苗，由鸡传染性法氏囊病毒病毒样颗粒制得的亚单位疫苗。将亚单位疫苗在预防鸡传染性法氏囊病病毒引起的鸡相关疾病中应用。本发明专利技术生产成本低、操作简单、生物安全性好，疫苗可有效预防鸡传染性法氏囊病毒对鸡群的感染。

【技术实现步骤摘要】
鸡传染性法氏囊病病毒VP2基因、其表达产物、其亚单位疫苗及应用
本专利技术涉及生物工程
，具体涉及一种鸡传染性法氏囊病病毒VP2基因、其表达产物、其亚单位疫苗及应用。
技术介绍
鸡传染性法氏囊病(InfectiousBursalDisease，IBD)是由传染性法氏囊病病毒(InfectiousBursalDiseasevirus，IBDV)引起的一种严重损伤3～6周龄雏鸡主要免疫器官—法氏囊的急性和高接触性的病毒性传染病。其发病特点是：鸡群感染IBDV后，发病率高（80%～100%），病程较短(持续一周康复)，感染后康复鸡易产生免疫抑制。其主要临床症状包括食欲不振，精神高度沉郁，间歇性腹泻，拉血便，体重减轻等。剖检可发现肌肉出血，肾脏肿大，尿酸盐沉积，法氏囊出血，萎缩或肿大等特征。雏鸡早期感染IBDV会引起严重的免疫抑制。导致的疾病如坏死性皮炎、包涵体肝炎—贫血综合征、大肠杆菌感染和免疫失败。最初爆发的流行毒株的致死率为20%～30%，近二十年来，随着变异株和超强毒株的不断出现，致死率可达50%～100%，给养禽业带来了巨大的经济损失。现有技术防控IBD的主要方法仍然是疫苗接种。科研工作者通过各种系统研发IBD疫苗，常用的疫苗成分包括动物病毒、细菌、弱毒微生物、灭活微生物和毒素，科研人员根据这些病原微生物的特性而运用不同的方法来制备疫苗。这些疫苗安全可靠对预防IBD的流行起到了关键性作用。近年来，随着IBDV超强毒株和变异株的不断出现，传统疫苗并不能完全有效的保护鸡群，免疫失败时有发生。IBDV野毒株的变异主要发生于流行过程之中，表现为超强毒株和弱毒株的出现。疫苗毒株的变异主要因为在疫苗制备过程中不断的传代以及现场使用后连续在鸡内传代所造成，主要表现为抗原性的漂移、增殖能力及毒力的变化。分子结构的改变导致病毒致病力及宿主对疫苗应答的改变，使得传统的疫苗已不能完全控制其流行。因此，亟需开发研制新型有效的疫苗以达到有效防治该类传染病之目的。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种鸡传染性法氏囊病病毒VP2基因、其表达产物、其亚单位疫苗及应用。为解决上述技术问题，本专利技术采用如下技术思路：专利技术人利用大肠杆菌密码子的偏嗜性对IBDVVP2序列进行优化并合成，在原核大肠杆菌中表达IBDVVP2蛋白，所表达的VP2蛋白的可溶性得到了明显提高，且该VP2蛋白能在适宜条件下能自组装成VLP，用VP2蛋白和其组装的病毒样颗粒（VLP）分别制成的亚单位疫苗免疫SPF鸡，可诱导良好的特异性免疫反应，以用于生产预防IBDV的疫苗。具体技术方案如下：本专利技术提供了一种鸡传染性法氏囊病病毒VP2基因，其DNA序列为：如SEQIDNO.1所示，或编码SEQIDNO.2所示蛋白序列的DNA序列。本专利技术提供了一种克隆上述VP2基因的引物，其核苷酸序列如SEQIDNO.3所示和/或如SEQIDNO.4所示。本专利技术提供了一种表达载体，含所述的核酸序列和组氨酸标签，所述组氨酸标签与所述核酸序列的C端或N端连接并融合表达。本专利技术提供了一种工程菌，为由所述表达载体转化而得的重组大肠杆菌。本专利技术提供了一种鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白，由所述核酸序列编码、所述表达载体表达或所述的工程菌分离而得。本专利技术提供了一种鸡传染性法氏囊病亚单位疫苗，由所述鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白和矿物油免疫佐剂混合制得。本专利技术提供了一种由所述鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白自组装而成的鸡传染性法氏囊病毒病毒样颗粒。本专利技术提供了一种鸡传染性法氏囊病亚单位疫苗，由所述鸡传染性法氏囊病毒病毒样颗粒和免疫佐剂混合制得。优选的，所述免疫佐剂为铝佐剂、蜂胶佐剂、油水双相佐剂中的一种。本专利技术提供了所述的亚单位疫苗在预防鸡传染性法氏囊病病毒引起的鸡相关疾病中的应用。与现有技术相比，本专利技术的有益技术效果在于：1.本专利技术构建的重组表达菌株可有效稳定持续表达VP2蛋白，且表达量高，在非高密度发酵条件下，琼扩效价可达1：256，在高密度发酵条件下可进一步提高产量，生产成本低。2.本专利技术表达的VP2经初步纯化后，可有效组装VLP，具有天然的抗原活性。3.本专利技术将VP2蛋白及其纯化后组装的VLP作为抗原制备的亚单位疫苗可有效刺激动物机体产生抗体，抗体效价明显高于现有商业化基因工程亚单位疫苗，可有效预防IBD的发生。4.本专利技术纯化后的VP2蛋白可作为基因工程抗原用于ELISA标准抗原的制备，或AGP等其它标准抗原的制备。5.本专利技术的技术方案制备的鸡传染性法氏囊病亚单位疫苗抗原纯度高、安全性好，免疫原性强，且对鸡等动物没有致病性。本专利技术的亚单位疫苗通过大肠杆菌表达，因此制备过程相对简单，成本低。附图说明图1为一种原核表达载体pET28a-VP2的酶切鉴定图谱；其中，M1：DNAMarkerDL2000，M2：DNAMarkerλHindⅢ，1和2：pET28a-VP2双酶切结果；图2为一种SDS-PAGE分析VP2蛋白纯化的示意图；其中，M：蛋白质分子量标准；1：VP2蛋白原液；2～5：纯化的VP2蛋白；图3为一种Western-blot分析VP2蛋白纯化的示意图；其中，M：蛋白分子量标准；1～4：纯化的VP2蛋白；图4为一种琼脂扩散试验检测VP2蛋白活性的结果示意图；其中，0：IBDV标准阳性血清；1：IBDV标准阳性抗原；2～6：倍比稀释的VP2蛋白；图5为一种VP2蛋白组装成病毒样颗粒的电镜检测结果示意图；其中，纯化后的VP2蛋白用磷酸盐缓冲液透析后，经磷钨酸负染后用透射电镜进行观察。图6为一种VP2蛋白组装病毒样颗粒的动态光散射检测结果示意图；其中，纯化后的VP2蛋白经磷酸盐缓冲液透析后，用MalvernNano-ZS纳米粒度仪进行检测。具体实施方式下面结合附图和实施例来说明本专利技术的具体实施方式，但以下实施例只是用来详细说明本专利技术，并不以任何方式限制本专利技术的范围。在以下实施例中所涉及的仪器设备如无特别说明，均为常规仪器设备；所涉及的试剂如无特别说明，均为市售常规试剂；所涉及的试验方法，如无特别说明，均为常规方法。实施例一：构建重组载体pET28a-VP21.VP2基因的合成参照IBDVB87株VP2基因序列(GenBankno.DQ906921)，综合因素对序列进行优化，例如大肠杆菌的密码子偏嗜性。人工合成VP2基因，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，氨基酸序列如SEQIDNO.2所示，连入载体得pUC57-VP2。2.VP2基因的PCR扩增（1）根据合成基因VP2的序列为模版，设计一对引物用于扩增VP2片段，引物由上海生工公司合成，引物如下：EF：cgGAATTCATGACCAATCTGCAAGER：cgCTCGAGCAATGCGACGAATA（2）在上游引物EF的5’端引入限制性酶切位点BamHI，在下游引物ER的3’端引入限制性酶切位点XhoI。以pUC57-VP2为模版，PCR扩增体系如下：表1PCR反应体系。PCR反应条件：95℃预变性2min，95℃变性1min，62℃退火1min，72℃延伸1min30s，30个循环；最后72℃延伸7min。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，大小为1356bp，与预期一致。3.VP2基因与质粒pET28a的连接（1）将本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种鸡传染性法氏囊病病毒 VP2基因，其DNA序列为：如SEQ ID NO.1所示，或编码SEQ ID NO.2所示蛋白序列的DNA序列。

【技术特征摘要】
1.一种鸡传染性法氏囊病病毒VP2基因，其DNA序列为：如SEQIDNO.1所示，或编码SEQIDNO.2所示蛋白序列的DNA序列。2.一种克隆权利要求1所述VP2基因的引物，其核苷酸序列如SEQIDNO.3所示和/或如SEQIDNO.4所示。3.一种表达载体，其特征在于，含权利要求1所述的核酸序列和组氨酸标签，所述组氨酸标签与所述核酸序列的C端或N端连接并融合表达。4.一种工程菌，其为由权利要求3所述表达载体转化而得的重组大肠杆菌。5.一种鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白，其特征在于，由权利要求1所述核酸序列编码、权利要求3所述表达载体表达或权利要求4所...

【专利技术属性】
技术研发人员：张改平，刘运超，蒋大伟，陈玉梅，刘东民，赵建国，魏蔷，冯华，周景明，刘燕凯，邓瑞广，
申请(专利权)人：河南省农业科学院，河南中泽生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：河南,41