一种羧肽酶B分泌表达的方法技术

本发明专利技术公开了一种羧肽酶B分泌表达的方法，所述方法包括如下步骤：(1)以信号肽OmpA、PelB、Endoxylanase和OmpT序列为出发序列，分别进行定点突变；(2)制备核苷酸序列SDB‑pCPB‑6×His；(3)制备重组表达载体；(4)将重组表达载体转化至宿主大肠杆菌E.coli BL21并诱导表达pCPB；(5)酶切上述pCPB并纯化CPB。本发明专利技术通过对信号肽的改造，能够将羧肽酶原B直接分泌到培养基中，相比于胞内和周质表达，不需要破碎细胞，回收与纯化更能容易操作。另外，培养基中空间足够大，利于重组蛋白的过量表达。

A Secretory Expression Method of Carboxypeptidase B

The invention discloses a method for secretion and expression of carboxypeptidase B, which comprises the following steps: (1) site-directed mutagenesis using signal peptide OmpA, PelB, Endoxylanase and OmpT sequences as starting sequences; (2) preparation of nucleotide sequence SDB pCPB 6*His; (3) preparation of recombinant expression vector; (4) transformation of recombinant expression vector into host E.coli BL21 and induction of expression of pCPB. (5) Enzymatic digestion of the above-mentioned pCPB and purification of CPB. By modifying the signal peptide, the carboxypeptidase B can be secreted directly into the culture medium. Compared with intracellular and periplasmic expression, the method does not need to break up cells, and the recovery and purification are easier to operate. In addition, the space in the medium is large enough to facilitate the overexpression of recombinant protein.

【技术实现步骤摘要】
一种羧肽酶B分泌表达的方法
本专利技术涉及基因表达的
，尤其是涉及一种在羧肽酶原B基因的N端添加信号肽突变体使目的蛋白在大肠杆菌中可溶性分泌表达的方法。
技术介绍
羧肽酶B(CarboxypeptidaseB，简称CPB，EC3.4.17.2)是一类含有锌离子的金属酶，能够特异性地切除蛋白或多肽C末端的碱性氨基酸，尤其是精氨酸和赖氨酸。羧肽酶B含307个氨基酸，分子量为35kDa。羧肽酶原B是羧肽酶B的酶原形式，胰蛋白酶可将羧肽酶原B激活，得到有活性的羧肽酶B。羧肽酶B的应用范围十分广泛，主要用于科研、医学诊断和药物生产。特别是，在胰岛素原活化为胰岛素的过程中，羧肽酶B是不可缺少的双酶之一。目前制备活性CPB的方法主要有两类：一类是从猪或牛的胰腺中直接提取并活化获得，但得到的CPB不仅产量低、成本高，而且还可能混有蛋白酶或感染物质(如病毒)，因此应用有限；另一类是在原核(主要是大肠杆菌表达系统)或真核中通过基因重组的方法制备CPB。真核系统具有发酵周期长、成本高的缺点，不适合工业大规模生产。原核表达系统易于形成包涵体，必须经过变性、复性才能得到活性蛋白，操作繁琐、复性效率低；张本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种羧肽酶B分泌表达的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：(1)以信号肽OmpA、PelB、Endoxylanase和OmpT序列为出发序列，分别进行定点突变；(2)在编码羧肽酶原B的基因序列的N端添加信号肽突变序列，在编码羧肽酶原B的基因序列的C端添加编码组氨酸标签的密码子，得到核苷酸序列SDB‑pCPB‑6×His；(3)将步骤(2)确定的核苷酸序列SDB‑pCPB‑6×His克隆到载体PTIG‑TRX，获得重组表达载体；(4)将重组表达载体转化至宿主大肠杆菌E.coli BL21并诱导表达pCPB；(5)酶切上述pCPB并纯化CPB。

【技术特征摘要】
1.一种羧肽酶B分泌表达的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：(1)以信号肽OmpA、PelB、Endoxylanase和OmpT序列为出发序列，分别进行定点突变；(2)在编码羧肽酶原B的基因序列的N端添加信号肽突变序列，在编码羧肽酶原B的基因序列的C端添加编码组氨酸标签的密码子，得到核苷酸序列SDB-pCPB-6×His；(3)将步骤(2)确定的核苷酸序列SDB-pCPB-6×His克隆到载体PTIG-TRX，获得重组表达载体；(4)将重组表达载体转化至宿主大肠杆菌E.coliBL21并诱导表达pCPB；(5)酶切上述pCPB并纯化CPB。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述信号肽OmpA的第3位密码子C突变成G，信号肽OmpA突变体的序列如SEQIDNO.1所示。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述信号肽PelB的第7位密码子T突变成A，第9位密码子...

【专利技术属性】
技术研发人员：张梁，於瑞梅，辛瑜，顾正华，李由然，丁重阳，石贵阳，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32